热休克蛋白70在急性肾损伤中的临床价值

曾健 林肇得 罗福漳 邓朝蓬 黄胜 邓雪强

热休克蛋白70(HSP70)是所有原核细胞和真核细胞在高温或应激情况下所产生的一组具有高度保守性的蛋白质。HSP家族是HSP70中最保守和最主要的一类，它在不同的生物中数量和功能均有所不同，在大多数生物中含量最多，而且在细胞应激后生成最为显著，因此受到广泛的关注，也是研究得较为深入的一类HSP。国内外有大量动物及临床实验已经证实HSP70在心肌、肝脏以及脑的缺血再灌注损伤中高表达并起到保护作用［1-3］，而对肾脏研究方面较少。近几年来，其在急性肾损伤(AKI)中的作用引起特别的重视，热休克蛋白70与肾损伤关系已成为国内外的研究热点。本研究的目的在于通过检测急性肾损伤患者不同时期血液和尿液中HSP70水平的动态变化，以及分析其与肾功能、致炎因子的相关性，探讨HSP在急性肾损伤中的肾脏保护作用和机制。

1 资料与方法

1.1 对象 选择2008年9月至2011年2月期间，收治于佛山市南海区人民医院患者，住院内期间新发急性肾损伤男性或女性的患者36例，年龄18～70岁。设置对照组：(27例)均为健康志愿者，男性或女性，年龄20～65岁。本研究符合医学研究伦理准则(赫尔辛基宣言)。

1.1.1 入选标准包括 参照2005年9月在阿姆斯特丹举行的急性肾衰竭(ARF)国际研讨会提出的急性肾损伤(AKI)定义(诊断标准)是指由导致肾脏结构或功能变化的损伤引起的肾功能突然(48 h以内)下降，表现为血肌酐(Cr)绝对值增加≥0.3 mg/dl(≥26.4 μmol/L)，或者增加≥50%(达到基线值的1.5倍)，或者尿量 ＜ 0.5 ml/(kg·h)，持续超过6 h。并将AKI分为1、2、3期，分别为急性肾损伤1期(危险期)：血清肌酐升高≥0.3 mg/dL(26.4 μmol/L)或为基线值的1.5～2倍;或者尿量＜0.5 ml/(kg·h)，持续＞6 h。急性肾损伤2期(损伤期)：血清肌酐升高至基线值的2～3倍;或者尿量＜0.5 ml/(kg·h)，持续＞12 h。急性肾损伤3期(衰竭期)：血清肌酐升高至基线值的3倍或在血清肌酐＞4 mg/dl(354 μmol/L)基础上急性增加0.5 mg/dL(44 μmol/L);或者尿量＜0.3 ml/(kg·h)持续＞24 h或无尿持续＞12 h。

1.1.2 排除标准 ①有慢性肾病病史者。②虽无肾病病史但住院体检发现肾功能异常者。③有糖尿病，红斑狼疮及肾肿瘤病史者。④已发生多脏器功能衰竭再出现休克者。

1.2 方法 患者住院期间行肾损伤标志物包括尿、血、组织检测或影像学方面的检测，同时记录尿量，确定符合新发的急性肾损伤的患者。动态观察肾损伤患者各项指标，按照分期系统进行分期(AKI 1期、AKI 2期、AKI 3期)，检测AKI患者各期与对照组，使用ELISA检血HSP70、尿HSP70、血TNF-α、血IL-1等因子，应用BeckmanDUC28型自动生化分析仪测定血清 BUN、Cr。

1.3 统计学方法 用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料数据用±s表示，两组间比较使用独立样本t经验，多组间相互比较采用方差分析，相关性分析采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 基本特征 对照组和与急性肾损伤患者年龄、性别、体质量指数在相互之间的分别差异无统计学意义。

2.2 生化指标 AKI患者各期血HSP70、尿HSP70、血BUN、血Cr显著性高于对照组(P＜0.05)，AKI 3期血 HSP70、尿HSP70、血BUN、血Cr高于AKI 1期比较有统计学意义P＜0.05。AKI患者各期 TNF-α、IL-1显著性高于对照组(P＜0.05)。AKI 3期血TNF-α、IL-1浓度低于AKI 1期比较有统计学意义P＜0.05见表1。

表1 急性肾损伤患者各期与对照组各项指标分析(±s)

表1 急性肾损伤患者各期与对照组各项指标分析(±s)

注：*与对照组比较P＜0.05，＊＊与AKI1期比较P＜0.05

类别 组数 血HSP70(ng/ml) 尿hsp70(ng/ml) BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) TNF-α(pg/ml) IL-1(pg/ml)对照组 27 4.52±1.24 2.13±1.02 5.25±1.24 68.6±13.5 8.17±2.11 54.12±13.5 AKI 1 36 12.57±2.36* 4.56±2.12* 10.33±3.64* 125.8±24.7* 63.23±13.35* 136.76±56.27*AKI 2 36 15.67±3.28* 7.62±2.14* 15.72±6.75* 186.7±37.5* 50.12±10.32* 110.32±35.46*AKI 3 36 22.68±4.78＊＊ 10.34±3.14＊＊ 23.82±5.44＊＊ 328.6±62.5＊＊ 20.34±7.14＊＊ 80.43±28.32＊＊

2.3 Pearson相关性分析结果 急性肾损伤患者在急性损伤期血HSP70与血BUN、血Cr、尿HSP70呈正相关(r=0.826，P＜0.05;r=0.923，P ＜0.05;r=0.872，P ＜0.05.)，与 TNF-α、IL-1炎性因子呈负相关(r=-0.927，P＜0.05 r=-0.783，P＜0.05.)。

3 讨论

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)又称应激蛋白，是生物体内或离体细胞产生的一组具有高度保守性的蛋白质，目前已发现10多种，根据分子量的不同，可将HSP分为HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和泛醌辅酶 Q等。诱导HSP产生的因素很多，大致分为以下三类：①环境性应激因素，物理性损伤如热、有机物、氧化剂、某些药物等。②病理生理性应激因素，微生物感染、组织损伤、炎症反应、细胞因子等。③正常情况下细胞生长和分化、胚胎发育等。HSP一般不直接发挥生物学作用，而是通过帮助新生蛋白质的正确折叠、移位、维持和受损蛋白质的修复、移除、降解，在应激的不利条件下，提高细胞的抵抗力，起到应激保护作用，HSP的生物学功能可归纳为以下几个方面：①分子伴侣作用：HSP与其他蛋白质结合，协助与其结合的蛋白质维持构象，参与蛋白质的变构、转运及降解，而自身不参与蛋白质组成，在应激状态下，与变性蛋白质结合，促进其修复或消除，在维持受损细胞的生存和功能中更是发挥重要作用。②抗氧化作用：具有抗氧化的生物活性，通过抑制产生氧自由基的关键酶即还原型辅酶氧化酶，减少氧自由基的产生和增加内源性抗氧化剂加速氧自由基的清除两方面降低细胞内的氧自由基，保护细胞免受氧化损伤［4-6］。③抗凋亡作用：研究已证实，HSP70、HSP60均可通过干扰引起凋亡调节蛋白激活的信号转导通路抑制细胞的凋亡，进而减少组织的损伤，促进应激损伤的恢复。④协同免疫应答：HSP具有类似主要组织相容性复合物结合抗原肽的结构域，结合抗原肽形成HSP-肽复合物，保护抗原肽免受酶降解，并通过自身ATP酶活性及可能的蛋白酶活性对其结合的前体抗原肽分子进行修剪，或者由内质网腔外肽酶进行修剪，使抗原肤适合与分子结合，辅助抗原呈递，增强免疫应答。

目前国内外对于HSP70细胞内表达规律的认识在不断深化，近年研究表明，结构型HSP70(HSP73)在正常肾组织有一定量的表达，经过应激或缺血/缺氧后，细胞内HSP70合成机制被启动，诱导型HSP70(HSP72)合成将显著增加，并增强机体对随后进一步损伤的抵抗功能。Martinez等［7］对HSP70的基因结构及调控作过较多的研究，认为当细胞应激后，细胞内未折叠或变性蛋白增多，启动热体克蛋白基因的转录和表达而合成HSP70。本研究对象中急性肾损伤中血、尿HSP70浓度明显高于对照组，研究表明，肾组织缺血时，HSP70表达上调。张鸿彦等［8］在庆大霉素引起的急性肾小管损伤中，肾组织HSP73(结构型HSP70)的表达也上调，并且肾小管上皮细胞中HSP73重新分布，由细胞核向细胞浆转移。HSP具有细胞保护作用，并参与损伤的修复过程。亚砷酸钠、小剂量环胞菌素A、短暂输尿管结扎等均可诱导HSP70的表达上调，对随后的缺血/再灌注或肾毒药物引起的肾组织损伤有明显的保护作［9-11］。此外，国内周立文等［12］有报道在相同性质但程度不同的应激条件下，HSP70的合成将随损伤程度的加深而增加。本研究对象中急性肾损伤中血、尿HSP70在AKI3期较AKI 1期明显增多有统计学意义，血HSP70与血BUN、血Cr正相关说明HSP70升高可能与肾组织的肾损伤成正比，这与McCabe等［13］曾报道整体动物热应激后组织损伤的程度与IISP70阳性显成正比相一致。

急性肾损伤的患者有大量活性氧族(ROS)，淋巴细胞释放细胞因 IL-1，IL-2，IL-8及 TNF-α等，ROS及细胞因子上调HSP，激活 HSP基因，增强 HSP的表达，使血浆中 HSP70的表达继续上升达高峰。较早出现的高表达的 HSP70通过发挥其“分子伴侣”作用，抗氧化、抗细胞凋亡、抗炎症损伤，参与细胞保护等内源性保护机制对肾组织起保护作用，促进了肾功能的恢复，本实验研究研究与血HSP70与TNF-α、IL-1炎性因子呈负相关。可能HSP70的升高抑制炎症因子的表达，从而对减少对细胞的损伤。一些研究表HSP70表达增加有明显的抗炎症作用，HSP70的抗炎症作用与其抑制NF-kB的活性，减少炎症介质产生，以及增加抗炎细胞因子IL-10的表达有关。NF-κB与炎症反应密切相关，HSP70可抑制TNF-α和IL-1β对 NF-kB的激活，进而抑制 TNF-α和 IL-8的表达［14］。

综上所述，急性肾损伤HSP70表达增多反映肾损伤的严重程度，同时HSP70表达可能抑制炎症因子的的激活，启动了内源性保护机制，利于肾脏损伤的修复。

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