兰州肉苁蓉HPLC指纹图谱研究

2011-08-07朱旭江贺军权杜兴刘霞中国科学院兰州化学物理研究所兰州市730000甘肃省食品药品检验所兰州市730000中国科学院研究生院北京市100039

中国药房 2011年47期

朱旭江，贺军权，杜兴，刘霞（1.中国科学院兰州化学物理研究所，兰州市730000；.甘肃省食品药品检验所，兰州市 730000；3.中国科学院研究生院，北京市 100039）

兰州肉苁蓉，种名为Cistanche Lanzhouensis Z.Y.Zhang.，生于荒漠草原、半荒漠的山前平原及沙质梁地和黄土丘陵、河谷沟等地。兰州肉苁蓉寄主单一，目前仅发现其寄生于植物红沙Reaumuria soongorica（Pall.）Maxim的根上，常在海拔1 500～2 000m，多在1 600m左右红沙分布广的地区分布。2010年版《中国药典》（一部）将列当科植物肉苁蓉（C.deserticola Y.C.Ma）和管花肉苁蓉（C.tubulosa（Schrenk）Wight）共同作为肉苁蓉的基原植物[1]。肉苁蓉味甘、咸、微辛酸，性微温，在《神农百草经》中列为上品[2]，具有极高的药用价值，有“沙漠人参”之美誉，是我国传统的名贵中药材，具有滋肝养肾、益精血、润肠通便之功效[3～9]。肉苁蓉主要含苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素苷类、多元醇、多糖等成分[10]，其中苯乙醇苷类物质为肉苁蓉补肾益精的主要有效成分[11，12]，具抗氧化、神经保护、改善学习记忆、免疫调节等作用[13]。由于多年的破坏性采挖，野生肉苁蓉资源已濒临枯竭，肉苁蓉已被列入二级濒危保护植物，并收入《国际野生植物保护名录》[14～16]。在某些地方，兰州肉苁蓉也被当作肉苁蓉入药[17]，且兰州肉苁蓉的多糖含量和正品肉苁蓉相当[18]。目前兰州肉苁蓉的特征图谱研究尚未见报道，因此本试验采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法建立兰州肉苁蓉甲醇提取物的特征图谱，为建立其稳定、可靠、全面的质量评价和品种鉴别方法提供科学依据。

1 仪器与试药

HPLC仪，含1525型输液泵、2487型紫外检测器、2996型检测器、717型自动进样器、Empower色谱软件（美国Waters公司）；KQ5200型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司，频率：40 kHz，功率：200W）。

肉苁蓉对照药材、毛蕊花糖苷对照品、松果菊苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为1101-212300001、1530-200202、11167-200503）；肉苁蓉 C.deserticola（来源：新疆）、肉苁蓉C.deserticola（来源：青海）、盐生肉苁蓉C.salsa（来源：甘肃酒泉）、兰州肉苁蓉C.Lanzhouensis（来源：兰州市区及各郊县，共10批）均由原兰州市药品检验所专家鉴定为真品，标本现存于甘肃省食品药品检验所；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：ZORBAX SB C18（250mm×4.6mm，5µm）；检测波长：330 nm；流速：1.0m L·m in-1；柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）。理论板数以毛蕊花糖苷峰计算应不低于2 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液精密称取毛蕊花糖苷对照品20.12mg，置100m L棕色容量瓶中，作为毛蕊花糖苷对照品贮备液；精密称取松果菊苷对照品14.00mg，置50m L棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为松果菊苷对照品贮备液。取上述贮备液各5 m L，分别置10m L棕色容量瓶中，分别制成每1m L含毛蕊花糖苷对照品0.1mg和每1m L含松果菊苷对照品0.14mg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液样品粉碎后过四号筛，精密称取粉末1 g，用甲醇超声提取3次（30、20、20m L），每次15m in，滤过，合并滤液，浓缩至干，用10%乙腈定容至10m L，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 G radientelution

2.3 方法学考察

2.3.1 参照物试验精密吸取毛蕊花糖苷对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，其主峰的保留时间用于确定肉苁蓉药材中毛蕊花糖苷的峰位。

2.3.2 进样精密度试验取同一份兰州肉苁蓉（兰州市）供试品溶液适量，连续进样6次，每次10μL，记录色谱图。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别＜2%和3%，表明方法精密度良好。

2.3.3 重复性试验精密称取兰州肉苁蓉药材（兰州市）粉末适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样10μL进行分析。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3%，表明方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验取同一份兰州肉苁蓉（兰州市）供试品溶液，分别于0、3、6、12、24、48 h时进样10 μL进行分析。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3%，表明供试品溶液在室温放置48 h内稳定。

3 结果

3.1 样品的测定

取10批不同产地的兰州肉苁蓉药材粉末各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，并记录110min内的色谱图。将10批兰州肉苁蓉的HPLC特征图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件计算相似度。指纹图谱见图1。

图1 10批兰州肉苁蓉的HPLC指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprints for 10 batchesof C.Lanzhouensis

3.2 特征图谱共有峰的确定

根据10批兰州肉苁蓉检测结果，按照特征图谱的技术要求[19]标出兰州肉苁蓉色谱图中13个共有峰。各共有峰的保留时间为：峰 1（23.013 m in），峰 2（27.883 m in），峰 3（33.601 m in），峰 4（56.114 m in），峰 5（58.716 m in），峰 6（69.460 min），峰 7（70.081 min），峰 8（84.001 min），峰 9（S，87.918 min），峰 10（92.317min），峰 11（97.262min），峰 12（103.732 min），峰13（105.265min）。兰州肉苁蓉HPLC特征图谱见图2。

图2 兰州肉苁蓉HPLC特征图谱Fig 2 HPLC specific chromatogram of C.Lanzhouensis

图2 中，9号峰为参照物毛蕊花糖苷的色谱峰，9号和10号峰单峰面积占总峰面积的百分比均超过10%，其他峰均未超过5%。故以参照物峰即9号峰的峰面积和相对保留时间为1计算，10号峰的相对保留时间为（1.047±0.003），共有指纹峰的相对峰面积为（7.523±0.066），其余峰仅标定相对保留时间，详见表2。

3.3 相似度分析

指纹图谱反映的是样品整体的特征，进行指纹图谱比较可以反映样品之间的亲疏程度，而相似度可以定量地描述指纹图谱的相似程度。不同产地的兰州肉苁蓉指纹图谱采用“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件进行分析，该软件可将多个色谱图进行汇总比较，经计算得到可全面反映多个色谱图特征的对照模式色谱图，并以此模式为基准，计算每个色谱图与之比较的相似度。本试验采用相关系数评价兰州肉苁蓉的相似度，结果见表3。结果表明，各样本之间有很高的相似度，说明采用本法作为兰州肉苁蓉药材鉴定和质量评价的依据是切实可行的。

表2 兰州肉苁蓉HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间Tab 2 Relative retention time of common peaksof HPLC fingerprintsof C.Lanzhouensis

表3 兰州肉苁蓉相似度评价结果Tab 3 Sim ilaritiesof C.Lanzhouensis

3.4 兰州肉苁蓉与肉苁蓉的特征图谱比较

取肉苁蓉对照药材、不同产地的兰州肉苁蓉和肉苁蓉药材，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述供试品溶液和毛蕊花糖苷、松果菊苷对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样测定，并记录110m in内的色谱图，详见图3。

从图3可知，兰州肉苁蓉在肉苁蓉对照药材19.65、20.69、28.88、30.108、62.418、64.03、67.24、75.44、79.44、80.33、81.86 min 色谱峰处未见色谱峰，仅在 23.67、27.24、34.08、88.81、97.11m in与对照药材有共有峰。松果菊苷色谱峰保留时间为67.15min，毛蕊花糖苷色谱峰保留时间为88.62min。

3.5 兰州肉苁蓉与肉苁蓉的相似度评价

以肉苁蓉对照药材色谱为对照图谱，采用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004B版）”软件进行分析。B版须选用对照图谱，故采用肉苁蓉对照药材的色谱为对照图谱，其他样品与对照图谱进行相似度分析，结果见表4。

4 讨论

兰州肉苁蓉与肉苁蓉特征图谱差异较大。其一，色谱峰峰数有明显差异：与肉苁蓉相比，兰州肉苁蓉出现许多特征峰的缺失，说明化合物的种类有明显差异；其二，与肉苁蓉对照药材的相似度仅为0.04左右，说明兰州肉苁蓉与正品肉苁蓉存在较大的差异。

松果菊苷和毛蕊花糖苷为肉苁蓉的主要活性成分，2种成分的色谱峰保留时间分别为67m in和88m in。从结果分析，肉苁蓉对照药材、肉苁蓉（青海）和肉苁蓉（新疆）中松果菊苷峰峰形好、峰较高，含量也比较高，但兰州肉苁蓉在松果菊苷色谱峰处无色谱峰，说明兰州肉苁蓉中未检测出松果菊苷[20]。兰州肉苁蓉中毛蕊花糖苷的色谱峰较高，通过含量计算，兰州肉苁蓉（皋兰县）中毛蕊花糖苷含量高于肉苁蓉（青海）和肉苁蓉（新疆）的含量。

图3 HPLC特征图谱A.毛蕊花糖苷对照品；B.松果菊苷对照品；C.肉苁蓉对照药材；D.兰州肉苁蓉（永登县）；E.肉苁蓉（新疆）；F.肉苁蓉（青海）；G.肉苁蓉（酒泉市）；H.兰州肉苁蓉（兰州市）Fig 3 HPLC specific chromatogram s A.echinacoside control； B.acteoside control； C.Cistanches Herba reference substance；D.C.Lanzhouensis（Yongdeng）；E.C.deserticola（Xinjiang）；F.C.deserticola（Qinghai）；G.C.salsa（Jiuquan）；H.C.Lanzhouensis（Lanzhou）

表4 肉苁蓉和兰州肉苁蓉相似度评价结果Tab 4 Sim ilarity evaluation of C.deserticola and C.Lanzhouensis

文献报道采用乙腈-醋酸系统[21]作为流动相检测肉苁蓉药材，但由于兰州肉苁蓉成分复杂，在文献方法采用的梯度条件下，存在色谱峰重叠的情况。另外，醋酸体积分数较高，长期使用会影响色谱柱的使用寿命。因此，笔者比较了甲醇-水、乙腈-水系统，最后确定了乙腈-0.1%磷酸水溶液系统作为流动相。经试验采用梯度进行洗脱，得到的信息量较丰富，各成分峰形尖锐且分离度良好。采用DAD检测器进行全波长扫描，在210～380 nm区间选取不同波长，比较兰州肉苁蓉在230、280、330、334 nm波长下的HPLC图谱，结果在330 nm波长处色谱峰信息最多，且各峰分离良好，故选择330 nm为检测波长。试验中利用DAD检测器对HPLC图谱中主要色谱峰进行纯度检查，结果显示各主要色谱峰纯度较好，故本方法除了可以用于定性考察药材质量外，也可用于多种单一成分同时进行定量检测，使测定更加简便、快捷。

综上，该方法精密度、稳定性、重复性较好，可以作为肉苁蓉质量评价和品种鉴别的重要依据之一。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：126.

[2]王丽楠，陈君，杨美华，等.不同初加工温度对肉苁蓉有效成分含量的影响[J].中国药房，2007，18（21）：1 620.

[3]侯志华，常国文.肉苁蓉的药理学研究进展[J].中国民族医药杂志，2003，9（4）：3.

[4]曾菊香.浅谈肉苁蓉的临床新用途[J].中国医学杂志，2006，4（7）：375.

[5]盂广森，陈晓莉.肉苁蓉延缓衰老研究的进展[J].中医杂志，1996，37（8）：501.

[6]屠鹏飞，李顺成，楼之岑，等.三种肉苁蓉补肾壮阳药效比较[J].中药材，1996，19（8）：420.

[7]屠鹏飞，楼之岑，李顺成，等.肉苁蓉类润肠通便药效比较[J].天然产物研究与开发，1999，11（1）：48.

[8]张勇，王顺年，吴焕，等.肉苁蓉类药材及其炮制品通便作用的比较研究[J].中成药，1993，15（5）：20.

[9]张钰哲，杨玲玲，宋海峰，等.肉苁蓉抗应激药理作用及机制研究进展[J].国际药学研究杂志，2009，36（5）：344.

[10]屠鹏飞，出山武，张正高，等.肉苁蓉类生药中乙醇苷类成分的RP-HPLC分析[J].药学学报，1997，32（4）：294.

[11]Xiong Quanbao，Tezuba Y，Kaneko T，et al.Inhibition on nitric oxide by phenylethanoids in activated macrophages[J].Eur JPharmacol，2000，400（1）：137.