栀子环烯醚萜类通过犬血脑屏障后成分的检测Δ

张鹏，孟硕，李欣志，刘建勋（中国中医科学院西苑医院实验研究中心，北京市100091）

中药栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效，在中医临床中主要用于治疗高血压、高热黄疸、小便短赤等证。栀子果实中主要含有黄酮类、环烯醚萜类、环烯醚酮类、有机酸酯类等化合物，其中环烯醚萜类成分为国内、外公认的中药栀子的主要有效成分[1]。近年研究表明，栀子环烯醚萜类成分中栀子苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑组织有明显的保护作用[2]，并且栀子苷在脑缺血状态下的血药浓度和吸收效果优于正常状态，在体内停留的时间较长，消除较慢[3]。此外，栀子苷能以较高的透过率通过体外模拟的血脑屏障[4]，但栀子环烯醚萜类中不同成分是否能够在体通过血脑屏障还需要进一步的研究。因此，本研究采用犬iv栀子环烯醚萜类成分的给药方式，通过液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术对脑脊液的检测，分析栀子环烯醚萜类中透过血脑屏障的成分或代谢物，为中药栀子治疗中枢神经系统疾病提供物质基础，并有助于将来栀子治疗脑缺血机制研究的深入开展。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1200型高效液相色谱（HPLC）仪、chemstation工作站（美国Agilent公司）；BV Pulsera型X光机（荷兰Philips公司）；API4000Q-TRAP型三重四极杆串联MS仪（美国Applied Biosystem公司）；Bruker DRX-500NMR型核磁共振（NMR）仪（德国Bruker公司）；图谱由北京微量化学研究所分析中心代测。

1.2 试药

栀子苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：11079-200410）；栀子苷酸标准品（日本和光纯药工业株式会社，批号：CDR4496）；栀子药材，购自河北省安国市神农中药饮片有限公司，经内蒙古民族大学蒙医药学院图雅教授鉴定为真品；戊巴比妥钠、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

健康犬3只，2♂1♀，体重（16.5±1.7）kg，由北京海淀区学院路通利实验动物养殖厂提供（动物生产许可证号：SCXK（京）2010-004）。

2 方法与结果

2.1 栀子环烯醚萜的制备

栀子药材加水煎煮提取，通过中等极性大孔吸附树脂柱，反复精制，得到栀子环烯醚萜类成分，相当于含生药20mg·m L-1。

2.2 色谱条件

色谱柱：AgilentEclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（15∶85）；流速：1.0m L·m in-1；检测波长：238 nm；柱温：25℃；进样量：10μL。

2.3 脑脊液样品的预处理

采集犬脑脊液约300 μL，10 000 r·m in-1离心15m in，取上清液分装冻存，取10μL上清液进样分析。

2.4 供试品溶液的制备

取“2.3”项下处理的犬脑脊液100μL作为供试品溶液。

2.5 对照品溶液的制备

精密称取栀子苷对照品10 mg，置于25 m L量瓶中，加30%乙醇至刻度，摇匀，精密量取2m L，置于10m L量瓶中，加30%乙醇至刻度，摇匀，制成每1m L含80μg的溶液，备用。

2.6 动物实验

健康犬（实验前12 h禁食不禁水），称重，于前臂桡iv 3%的戊巴比妥钠30mg·kg-1麻醉，背卧固定于手术台上。清理头顶皮肤并75%乙醇消毒，在X光机引导下插入穿刺针至延髓池并固定，穿刺针尾部连接1m L注射器，用于采集脑脊液。同时分离股静脉，结扎远心端并插入静脉插管，用线结扎牢固，建立静脉给药通路。犬脑脊液穿刺X光片见图1。

图1 犬脑脊液穿刺X光片Fig 1 X-ray of cerebrospinal fluid obtained in dogs

2.7 给药和样品采集

每只犬从股静脉通路快速推注栀子环烯醚萜，注射剂量均为10m L·kg-1。注射完毕时间计为零，开始记录用药后取脑脊液时间，每间隔30min采集脑脊液100μL，持续90min，将3个时间段内收集到的脑脊液混合，按“2.3”项下方法离心取上清液后分装冻存，备用。每只犬在给药前采集200μL脑脊液作为空白对照。

2.8 色谱测定方法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入色谱仪进行测定。

2.9 犬脑脊液中栀子环烯醚萜类成分的分析

通过对照品对照分析认为，在脑脊液中的化学成分有栀子苷的原形，没有栀子苷的代谢产物京尼平和栀子苷酸。检测到的栀子环烯醚萜中除栀子苷（c）外，另有2个色谱峰b、a。通过反复体外层析分离，再经LC-MS检测发现，色谱b碎片离子峰与体内检测峰相一致，分子量为550。1H-NMR（D2O）δ：3.74（3H，s，COOCH3）、4.47（1H，d，J＝8Hz）、4.83（1H，d，J＝8 Hz）、5.26（1H，d，J＝7 Hz，H-1）、5.87（1H ，s，H-7）、7.55（1H，s，H-3）；13C-NMR（D2O，DSS为内标）δ：99.9（C-1）、155.2（C-3）、114.3（C-4）、37.0（C-5）、40.7（C-6）、132.7（C-7）、144.1（C-8）、48.4（C-9）、57.1（C-10）、173.0（C-11）、54.5（OMe）、101.4（C-1′）、75.4（C-2′）、78.6（C-3′）、72.4（C-4′）、78.4（C-5′）、71.3（C-6′）、105.8（C-1″）、75.8（C-2″）、78.4（C-3″）、72.3（C-4″）、78.3（C-5″）、63.5（C-6″），以上数据与文献[2]报道一致，鉴定为京尼平-β-D-龙胆双糖苷（Genipin-1-β-D-gentiobioside）。

同样，色谱 a LC-MS[M+Na]+m/z：427，分子量为 404。1H-NMR（D2O）δ：4.96（1H，d，J＝9 Hz，H-1）、7.69（1H，d，J＝1 Hz，H-3）、3.11（1H，m，H-5）、6.02（1H，d，J＝2 Hz，H-7）、2.65（1H，t，H-9）、3.74（3H，s，COOCH3）；13C-NMR（D2O）δ ∶100.4（C-1）、154.8（C-3）、106.5（C-4）、69.6（C-l1）、40.1（C-5）、3.8（C-6）、128.5（C-7）、148.9（C-8）、44.1（C-9）、59.8（C-10）、51.6（OMe）、98.7（C-1′）、73.8（C-2′）、72.5（C-3′）、69.2（C-4′）、75.9（C-5′）、60.3（C-6′），以上数据与文献[5]数据一致，鉴定为去乙酰基车叶草苷酸甲酯（Deacetyl-asperulosidic acidmethyl ester）。色谱见图2。

图2 高效液相色谱图A.空白脑脊液；B.含环烯醚萜类成分脑脊液；a.去乙酰基车叶草苷酸甲酯；b.京尼平-β-D-龙胆双糖苷；c.栀子苷Fig 2 HPLC chromatograms A.blank cerebrospinal fluid；B.cerebrospinal fluid containing iridoid compounds；a.deacetyl-asperulosidic acidmethyl ester；b.Genipin-1-β-D-gentiobioside；c.geniposide

3 讨论

血脑屏障是脑屏障最重要的组成部分，维持着中枢神经系统微环境的稳定，但同时也限制了多数药物进入脑组织对神经系统疾病的治疗作用。因此，通过血脑屏障是药物在中枢神经系统中发挥作用的前提条件。反之，将脑脊液中的化学组分进行生物活性的筛选，也是新药发现的重要途径。本研究对犬采用iv的方式给予栀子环烯醚萜类成分，在给药90 m in后脑脊液的检测中发现栀子环烯醚萜类成分中京尼平-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰基车叶草苷酸甲酯和栀子苷的存在。提示这3种化合物可能是栀子发挥中枢神经系统治疗作用的主要活性成分。在目前神经药理研究中，栀子苷可通过提高缺氧缺糖再灌注损伤神经细胞线粒体的活性[6]，减轻脑血管内皮细胞损伤，抑制脑缺血后炎症因子和黏附分子的表达[7]，以及对抗自由基[8]和Ca2+超载[9，10]引起神经元损伤等途径干预脑缺血损伤级联放大反应的不同环节，达到保护缺血脑组织的目的。结合本研究结果，笔者认为栀子苷透过血脑屏障是以上药理活性的直接原因和首要条件；京尼平-β-D-龙胆双糖苷和去乙酰基车叶草苷酸甲酯可能也具有一定的中枢神经药理活性，但这些设想还需要进一步分析验证。

在正常生理状态下，血脑屏障是由排列紧密的上皮细胞组成，物质交换方式为水溶性小分子直接经细胞间隙扩散，脂溶性分子经跨膜扩散，特异受体介导的胞饮作用，特异载体通道等。虽然本研究结果证实，京尼平-β-D-龙胆双糖苷、去乙酰基车叶草苷酸甲酯和栀子苷能够通过血脑屏障，但是透过的机制还需要进一步的深入研究。

[1]张留记，刘钦松，屠万倩，等.RP-HPLC法同时测定不同产地栀子中栀子苷、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量

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