银杏内酯B对胚胎大鼠中脑神经细胞的作用研究

谭才宏，钱小蔷，马洪峰（.江苏大学附属医院药剂科，镇江市00；.江苏丹阳市人民医院药剂科，丹阳市 300）

银杏提取物含有多种活性成分，包括银杏内酯A、B、C、M、J和白果内酯。银杏内酯B（GBE）具有抗炎、抗过敏、抗休克、抗肿瘤等广泛的生物学作用。其不但对缺血、缺氧等多种因素引起的神经细胞损伤有保护作用，而且还具有促进学习记忆、促进神经系统发育和神经干细胞向神经细胞分化，防治老年性痴呆等神经系统退行性疾病等诸多重要作用。从细胞学方面来说，近年来，GBE对细胞的作用研究很多，如GBE能拮抗谷氨酸所致的脑皮质神经细胞毒性作用；GBE对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用；GBE对胆固醇和载脂蛋白E4（ApoE4）共损伤海马神经元胆碱能系统具有保护作用；GBE可促进分化细胞成熟，促进神经干细胞向神经元分化；GBE可拮抗谷氨酸诱导的视网膜神经细胞凋亡等[1，2]。而GBE对中脑神经细胞的保护作用及其机制的探讨未见文献报道。

海人藻酸（KA）能使胞浆或线粒体内超氧化物岐化酶（SOD）水平降低或消失，其通过降低神经细胞对氧自由基的清除能力而使得氧自由基在神经细胞内聚集，引起细胞的继发性损伤[3～5]。因此，自由基导致细胞膜和线粒体损伤作用成为KA引起神经细胞损伤的主要因素。本文以此为模板探讨GBE对中脑神经细胞作用的机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

电子天平（上海天平仪器厂）；微量加样器（法国Gildon公司）；M 200型酶标仪（瑞士Tecan公司）；Mz12.5型体视显微镜（德国Leica公司）；CO2培养箱（美国Shellab公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；TDL-5C型台式低速离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）。

1.2 试药

GBE（批号：071204）、左旋多聚赖氨酸（批号：070716）、MTT（批号：070416）、KA（批号：080264）均购自美国Sigma公司；DMEM干粉培养基（批号：070405），胰蛋白酶（1∶250）均购自美国Gibco公司；胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司，批号：080103）；台盼蓝（上海欧韦达仪器科技有限公司）；神经生长因子（NGF，北京邦定公司，批号：070106）；一氧化氮（NO）、SOD、丙二醛（MDA）试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 动物

健康成年Wistar大鼠，♀♂（2∶1），体重（250±20）g，由江苏大学实验动物中心提供（动物生产许可证号：SYXK（苏）2008-0024）。下午6：00合笼，次晨镜检♀鼠阴道的精子，以检出精子为0 d，第14天孕鼠脱颈椎法处死。

2 方法

2.1 胚胎大鼠中脑神经细胞悬液的制备

取14 dWistar孕鼠，用颈椎脱落法处死，放入盛有75%酒精容器内，消毒5m in，于无菌条件下取出胚胎浸于培养基中，无菌取胎鼠中脑组织；用PBS液洗净血污，剪碎，置0.25%胰蛋白酶溶液中37℃消化5m in，吸除消化液，用含血清的培养基终止消化；加完全培养基反复吹打制成单细胞悬液。200目不锈钢筛网过滤。

2.2 胚胎大鼠中脑神经细胞的原代培养

用含10%胎牛血清的DMEM培养基将细胞密度调整至4×106个/m L的细胞悬液，细胞接种在涂有10mg·L-1左旋多聚赖氨酸多孔培养板上，于CO2培养箱中（37℃，5%CO2）培养。24 h待大部分细胞贴壁后，全量换液1次，以后每2～3 d半量换液。此法不需使用抑制胶质细胞的药物，减少了药物对神经细胞的损伤，使神经细胞生长更接近自然环境。

2.3 分组

试验分为7组，即正常对照、GBE对照（50mg·L-1）、KA（100 μmol·L-1）、NGF（50mg·L-1）和GBE高、中、低剂量（100、50、25mg·L-1）组。每个剂量为6孔，每孔400 µL。于中脑神经细胞培养第10天，分别测定指标。

2.4 神经元鉴定

采用神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组化法染色对原代培养的神经元进行鉴定。

2.5 中脑神经细胞内MDA、NO含量和SOD活性测定

用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化收集细胞，再用PBS漂洗3次，制成单细胞悬液，低温超声粉碎细胞，4 000 r·min-1离心，取出上清液待测。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活性；改良的硫代巴比妥酸法测定MDA含量；硝酸还原酶法测定NO含量。

2.6 统计方法

3 结果

3.1 NSE免疫组化染色对神经元的鉴定

NSE免疫反应呈棕黄色，颗粒状，阳性染色分布于神经元的胞质及突起中，神经胶质细胞不着色。GBE高、中、低剂量组细胞生长、分化程度明显好于KA组。免疫组化图片见图1。

图1 免疫组化图片A.正常对照组；B.GBE对照组；C.KA组；D.GBE低剂量组；E.GBE中剂量组；F.GBE高剂量组；G.NGF组Fig 1 Immunohistochem icalpictures A.normal control group；B.GBE control group；C.KA group；D.GBE low dose group；E.GBEmedium dose group；F.GBE high dose group ；G.NGFgroup

3.2 中脑神经细胞SOD活性和NO、MDA含量的测定

KA组SOD活性显著低于正常对照组（P＜0.01）；GBE高、中、低剂量组SOD活性随着GBE浓度的增大而增强，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）。

KA组MDA、NO含量显著高于正常对照组（P＜0.01）；GBE高、中、低剂量组MDA和NO含量随着GBF浓度的增大而逐渐减小，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）。中脑神经细胞SOD活性、MDA和NO含量测定结果见表1。

表1 中脑神经细胞SOD活性、MDA和NO含量测定结果（±s，n＝6）Tab 1 Results of the SOD activities，MDA and NO contents ofm idbrain neuron（s±s，n＝6）

表1 中脑神经细胞SOD活性、MDA和NO含量测定结果（±s，n＝6）Tab 1 Results of the SOD activities，MDA and NO contents ofm idbrain neuron（s±s，n＝6）

与正常对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与KA组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.KA group：#P＜0.05，##P＜0.01

NO/μmol·L-1 33.253±3.158 32.477±2.308 82.808±5.032＊＊78.453±2.089#62.873±3.284##51.390±2.400##60.266±3.737##组别正常对照组GBE对照组KA组GBE低剂量组GBE中剂量组GBE高剂量组NGF组SOD/U·mg-1 133.39±7.507 140.085±3.692＊79.600±2.128＊＊83.858±4.661#96.125±5.734##111.528±4.548##98.073±5.729##MDA/nmol·mg-1 2.747±0.088 2.613±0.107＊6.892±0.123＊＊6.618±0.222#6.358±0.189##5.965±0.112##5.933±0.143##

4 讨论

中脑神经细胞损伤是多种病理机制相互作用的结果。在诸多损伤机制中，主要是线粒体内电子传递失调致使氧分子接受单个电子生成氧自由基，同时黄嘌呤氧化酶（XO）系统被激活，XO在将ATP的降解产物次黄嘌呤转化为黄嘌呤的同时，产生大量氧自由基。另外，SOD等自由基清除系统被大量消耗，造成自由基堆积。自由基损伤的主要病理机制是引发脂质过氧化反应。由于脑组织中富含脂质，极易受到自由基的攻击，导致脂质过氧化反应，激起自由基连锁和增殖反应，形成一系列脂质自由基及其降解产物MDA。

越来越多的研究发现，自由基产生与脑缺氧、缺血性损伤有关，并认为氧化应激在其发生发展中起关键作用[6]。正常生物氧化过程中，活性氧自由基处于不断产生与清除的动态平衡中，当外界因素打破这种平衡时，过量产生的自由基可诱发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应。与其他脏器相比，胚胎中脑组织更易受自由基的攻击。脑内的SOD等抗氧化物水平改变，脑组织抗氧化能力就会失去平衡，因此胚胎中脑脂质过氧化的发生率最高[7]。脂质过氧化发展到一定程度使细胞膜失去流动性，膜电位降低，膜对离子通透性增加，线粒体不能产生能量，溶酶体水解酶外漏，与蛋白质反应灭活酶，抑制蛋白质的合成，产生细胞毒性作用，最终导致细胞破裂和组织溶解。

本研究用不同浓度GBE作用于中脑神经细胞，结果表明，当GBE浓度在25～100mg·L-1范围内具有明显的抗自由基作用，抑制脂质过氧化反应，增强细胞抵抗KA损伤的能力。其作用强度与NGF相当，这可能与GBE的分子结构有关。

从NO和MDA数据分析，GBE组与正常对照组相比相差不大。以前的研究表明，GBE能对兴奋性神经毒过程中的细胞提供保护作用[8]。在研究中笔者进一步发现，GBE只有在与KA同时使用处理细胞才能有效地抑制KA所致的神经细胞损伤，单独使用GBE对培养细胞的NO和MDA无明显影响。这间接的表明血小板活化因子（PAF）可能作为第二信使参与了KA诱导神经细胞损伤的信号传递过程，这与Mukherjee PK等[9]研究结果一致。GBE可能通过竞争PAF受体阻断PAF介导的兴奋性神经毒信号传递过程，提高抗氧化酶的活性和清除自由基，从而提供神经保护作用。GBE高、中、低剂量组NO和MDA含量远低于KA组（P＜0.01或P＜0.05），并呈现浓度依赖性，进一步说明GBE具有抗自由基作用，能更好地保护神经细胞的DNA蛋白质，使膜脂质不被氧化损伤。

综上所述，GBE对中脑神经细胞生长的促进作用和保护作用机制可能与GBE提高细胞的SOD活性，降低细胞的NO、MDA含量有关。

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