肾舒康合剂对马杉氏肾炎白兔肾组织形态的影响Δ

闫翠环，方敬，陈志强，王艳素，陈金金，刘云肖，姜秀娟（.河北医科大学，石家庄市05009；2.河北医科大学中医院，石家庄市 0500；.河北省人民医院，石家庄市 05005）

马杉氏肾炎（Masugiglomerulonephritis，MGN）是一种典型的抗肾小球基底膜性肾小球肾炎，其主要临床表现为肾病综合征（NS），随着疾病的发展甚至会引起肾功能的严重损伤[1]。前期研究证实[2]，肾舒康合剂能使阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）致膜性肾小球肾炎动物的尿蛋白明显减少，降低血清肌酐和血尿素氮的含量，改善肾组织的病理状态。笔者通过给白兔注射羊抗兔肾血清复制MGN模型，同时用肾舒康合剂进行干预性治疗，以探讨肾舒康合剂对MGN的治疗作用及其可能的机制，为临床用药提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HM IAS-2000型医学彩色图像分析系统（武汉千屏影像技术有限责任公司）；H7500型透射电镜（日本Hitachi公司）；LSM 510META型荧光显微镜、HM 340E型石蜡切片机（德国Zeiss公司）；UCT型超薄切片机（德国Leica公司）。

1.2 试药

肾舒康合剂（由黄芪、黄精、白花蛇舌草、地龙、川芎、积雪草、柴胡、丹参、生地黄、石苇组成，药材均购自河北省安国市一方中药材有限公司，由河北医科大学中医院中药房孟熙中药师鉴定为真品）由河北医科大学中医院提供（批号：20100209）；雷公藤多苷（湖南协力药业有限公司，批号：20050702）；弗氏完全佐剂（美国Sigma公司，批号：Lot102K8930）。

1.3 动物

清洁级成年绵羊1只，♀，体重25 kg，由解放军第二军医大学动物中心提供（动物生产许可证号：SCXK（沪）2007-0003）；健康新西兰种大耳白兔40只，♀♂兼半，体重1.75～2.25 kg，由武汉市新州区全耀动物养殖场提供（动物生产许可证号：SCXK（鄂）2004-0006）。

2 方法

2.1 复制模型与分组

按文献方法[3]制备羊抗兔肾血清，将所有白兔随机分为正常、模型、肾舒康合剂、雷公藤多苷组。除正常组外，其余各组白兔均经耳缘iv羊抗兔肾血清，每次2m L，间隔0.5 h注射1次，共6次。检测尿蛋白呈阳性反应，表明MGN模型复制成功[4]。

2.2 给药

文献报道[2]，肾舒康合剂对MGN模型白兔肾炎的治疗中，中剂量组与雷公藤多苷组疗效差异无显著性，3倍递增的高剂量组作用优于雷公藤多苷组，故笔者选择相当于中剂量组的生药剂量重点观测。各组用药量分别为：肾舒康组8.16 g·kg-1，雷公藤多苷组5mg·kg-1，模型和正常组给予等容量生理盐水，于复制模型成功后第1天开始ig给药，每天1次，连续4周。

2.3 标本采集与检测

2.3.1 光镜观察 于用药4周后杀检白兔，取部分肾组织，4%多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，以3μm的石蜡切片，行HE、PASM染色，光学显微镜下观察并拍片。置普通光学显微镜下观察肾小球及肾小管间质病变情况。每份标本于低倍镜下观察20个不同的肾小管间质视野，按肾小球纤维素沉积数、肾小管间质损伤指数进行半定量评分，评估肾小管间质损伤程度。

2.3.2 电镜观察 取右肾上极皮质1mm3，经2.5%戊二醛和1%锇酸磷酸钠缓冲液双固定，丙酮梯度脱水，815环氧树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并拍片。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 肾组织病理形态半定量图像分析结果

肾舒康合剂组和雷公藤多苷组与模型组比较，纤维素沉积数显著下降（P＜0.01），肾小管间质损伤指数显著下降（P＜0.05）。肾小球纤维素沉积数、肾小管间质损伤指数比较结果见表1（空白组略去）。

表1 肾小球纤维素沉积数、肾小管间质损伤指数比较结果（±s，n＝10）Tab 1 Com parison of the cellulose deposition number and tubular injury inde（x±s，n＝10）

表1 肾小球纤维素沉积数、肾小管间质损伤指数比较结果（±s，n＝10）Tab 1 Com parison of the cellulose deposition number and tubular injury inde（x±s，n＝10）

与模型组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.modelgroup：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别模型组肾舒康合剂组雷公藤多苷组肾小管间质损伤指数3.16±0.75 2.31±0.67＊2.28.±0.36＊n 81 0 10纤维素沉积数/%80.84±11.36 61.46±20.31＊＊61.24±19.73＊＊

3.2 光镜观察结果

3.2.1 HE染色 与正常组比较，模型组基底膜弥散性增厚，系膜基质增多，胶原纤维增生，可见局灶节段性肾小球硬化，肾小球囊壁层细胞增生，有新月体形成；肾小管上皮细胞颗粒样变性、肿胀，管腔狭窄，部分小管腔内可见蛋白、管型；间质有炎性细胞浸润。与模型组比较，肾舒康合剂组胶原纤维增生不明显，未出现肾小球硬化，未见新月体形成，肾小管间质病变明显减轻；雷公藤多苷组的病理改变与肾舒康组相似，但肾小管间质病变程度较肾舒康合剂组的略轻。病理切片（HE染色）见图1。

图1 病理切片（HE，400×）A.正常组；B.模型组；C.肾舒康合剂组；D.雷公藤多苷组Fig 1 Pathologicalslice（HE，400×）A.normal group；B.model group；C.Shenshukang mixture group；D.triptergium glycosidesgroup

3.2.2 PASM染色 正常组基底膜正常，呈黑色，系膜基质呈黑细丝状，肾小管间质无异常。模型组可见基底膜重度弥散性增厚，可见局灶节段性肾小球硬化，毛细血管内皮细胞变性，管腔扩张充血，间质有炎性细胞浸润，可见散在的纤维增生。与模型组比较，肾舒康合剂组未出现肾小球硬化，肾小球囊内壁光滑，未见新月体形成，毛细血管内皮细胞轻度肿胀；雷公藤多苷组的病理改变与肾舒康合剂组相似。病理切片（PASM染色）见图2。

图2 病理切片（PASM，400×）A.正常组；B.模型组；C.肾舒康合剂组；D.雷公藤多苷组Fig 2 Pathologicalslice（PASM，400×）A.normal group；B.model group；C.Shenshukang m ixture group；D.triptergium glycosidesgroup

3.3 电镜观察结果

正常组肾小球上皮细胞、内皮细胞、基底膜结构均正常，上皮细胞足突结构清晰，呈杵样并列排列于基底膜外侧；内皮细胞窗孔排列整齐；基底膜结构均匀完整。模型组肾小球基底膜呈节段性不规则增厚；上皮细胞足突肿胀，排列紊乱，出现节段性轻、中度融合，毛细血管内皮细胞严重肿胀。肾舒康合剂组与雷公藤多苷组肾小球基底膜增厚不明显，或仅呈轻度增厚，肾小球上皮细胞足突有部分融合；内皮细胞窗孔排列基本整齐；毛细血管内皮细胞无明显肿胀。病理切片（透射电镜）见图3。

图3 病理切片（透射电镜，20 000×）A.正常组；B.模型组；C.肾舒康合剂组；D.雷公藤多苷组Fig 3 Pathologicalslice（TEM，20 000×）A.normal group；B.model group；C.Shenshukang m ixture group；D.triptergium glycosidesgroup

4 讨论

MGN模型是于1900年由LindemanW首次介绍[5]，其后由Masugi加以发展和特征化，故名Masugi肾炎。它是异种抗体直接与肾小球基底膜上的抗原相结合形成的一种肾炎模型，是一种典型的抗肾小球基底膜的肾小球肾炎。慢性肾脏疾病最终导致终末期肾衰的发生，其特征是肾功能的逐渐丢失、细胞外基质（ECM）的持续堆积，从而导致间质纤维化。多种肾脏疾病肾功能的恶化很大程度上取决于间质损害的严重性[6]。

肾舒康合剂由黄芪、黄精、生地黄、丹参、川芎、石苇、白花蛇舌草、积雪草、柴胡、地龙10味中药组成，共奏健脾补肾、活血化瘀、清热利湿之功效。黄芪含有黄芪多糖、黄芪皂苷类、黄酮和黄酮类似物等成分，有清除自由基、促进蛋白质合成、诱生干扰素等作用；黄芪还富含微量元素硒，对肾小球基底膜的电荷屏障和机械屏障均有保护作用，从而减轻通透性蛋白尿，对肾性蛋白尿有减轻和消除作用，改善肾小管损伤和间质纤维化病变，保护肾组织[7，8]；与黄精、生地黄配伍还能提高机体的非特异性免疫力，发挥对肾组织的保护作用。丹参是治疗肾纤维化的常用中药之一，其分离出的有效成分丹参酮ⅡA磺酸钠可通过对肾组织结缔组织生长因子（CTGF）的抑制而发挥防治肾间质纤维化的作用[9]。川芎嗪能改善动物的高凝状态，减轻肾小球ECM过度凝集状态和肾间质单核巨噬细胞浸润所引起的炎症过程，减少尿蛋白，延缓肾功能损害[10]。丹参、川芎与地龙合用可起到改善高凝状态，清除自由基，抑制和排除免疫复合物的作用。白花蛇舌草有清热除湿、活血止痛等功效，其含有的总黄酮具有增强机体特异性免疫功能和非特异性免疫功能的作用，亦可以刺激网状内皮系统增生，增强吞噬细胞活力而达到抗菌消炎作用[11]。积雪草可以通过直接抑制生长转化因子（TGF-β1）的表达并间接维持重组人骨形态发生蛋白-7的表达来实现抗肾间质纤维化的作用[12]。

本研究结果表明，肾舒康合剂能明显抑制ECM和毛细血管内皮细胞的增生，减轻肾小管管腔狭窄的变化，通过保护肾小球滤过膜，修复损伤的肾小球上皮细胞发挥减轻病理损害、防止肾脏受到进一步损伤的作用。

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