鸭β-防御素-2基因的克隆测序与组织表达分析

张辉华，罗艳娜，，谢青梅，马静云，杨承忠，韩小凤，，毕英佐

（1.佛山科学技术学院生命科学院，广东 佛山 528231；2.华南农业大学动物科学院 ，广东 广州 510642）

防御素是一类古老的内源性抗菌多肽，广泛存在于动物体内。自Evans等［1］从鸡与火鸡异嗜性白细胞中发现β-防御素后，已陆续从鸡、鸭、鸵鸟、鹅和企鹅等禽类动物体内分离发现约30个禽β-防御素基因［2-6］。根据Lynn等［7］的建议，国际上对禽防御素命名进行了统一规定，所有禽来源的防御素都命名为AvBDs（Avian beta-defensins）。上传至NCBI GenBank中登记注册的鸭β-防御素基因序列有AvBD2、AvBD6、AvBD9、AvBD10。对鸭 AvBD2的生物学功能研究表明，体外具有抗菌活性与趋化活性［4，8-9］，具有潜在的应用价值。因此，本试验对鸭AvBD2基因进行了克隆、序列分析与比较及在机体各组织器官分布的研究，以期为对其功能及调控表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体与受体菌 质粒pMD-18T购自宝生物工程（大连）有限公司；受体菌JM109为华南农业大学家禽基因工程实验室保存。

1.2 工具酶与主要试剂 质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为Omega公司产品；Trizol Reagent Kit、AMV、Premix Ex Taq聚合酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.3 引物 根据GenBank上发表的鸭AvBD2（登录号：AY641439）及β-actin基因序列和PCR引物的设计原则，并借助计算机软件DNAStar进行辅助分析，设计了4条PCR引物，分别用于进行鸭AvBD2与β-actin基因的扩增。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下。

Duck2-P1：5′-GAGGGAAGGGACCAAGAAGA-3′；Duck2-P2：5′-GGTTGTAACAGGAAGGAGATT-3′；β-actin-P1：5′-ATGTACCCGGGCATCGCTG-3′；β-actin-P2：5′-TCAGAAGCATTTGCGGTGG-3′

1.4 肝脏总RNA提取 取脾脏组织约0.1g，按Trizol试剂盒说明方法提取总RNA。

1.5 鸭AvBD2基因的RT-PCR扩增 通过二步法进行RT-PCR。反转录反应体系：RNA 1μL，10x RT Buffer 1μL，dNTPs（各10mmol／L）1μL，RNA酶抑制剂0.25μL，Oligo dT-Adapter Primer 0.5 μL，AMV 0.5μL，MgCl22μL，DEPC水补至10 μL。混匀后，30℃反应10min，42℃反应30min，99℃反应5min，5℃冷却5min。反转录产物直接用于PCR扩增。PCR反应体系为：Ex Taq 12.5 μL，引物各0.5μL，模板1μL，双蒸水补至25μL。PCR程序：94℃预变性3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃后延伸10min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6 PCR产物的克隆与序列分析 PCR产物经过凝胶纯化回收后，与载体pMD-18T在下列反应体系中4℃过夜连接：Buffer 5μL，pMD-18T1μL，PCR产物4μL。连接产物直接用于转化JM109感受态细胞。挑取单个的白色菌落，接种于3mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，然后进行菌落PCR与酶切鉴定。酶切鉴定正确的进行测序。所获得的DNA序列用BLAST程序进行相似性检索比较。

1.7 鸭AvBD2的组织分布 取1日龄和20日龄“仙湖肉鸭”各3只，放血致死。采皮肤、舌、食道、气管、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、腔上囊、胸腺、骨髓、胸肌、腺胃、肌胃、小肠和胰脏组织各1g冻存。提取冻存组织RNA，进行RT-PCR，检测鸭AvBD2在各个组织器官的分布情况。

2 结果与分析

2.1 鸭AvBD2基因的RT-PCR扩增 取鸭肝脏组织，提取总RNA，用鸭AvBD2特异引物，经RT-PCR扩增得到一个基因片段，RT-PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，可以见到1条约350bp大小与预期长度相吻合目的电泳条带（图1）。PCR产物克隆至载体pMD-18T上，图2为其酶切及菌落PCR结果。

2.2 鸭AvBD2基因测序结果及分析 测序结果见图3。克隆片段核苷酸序列长为350bp，包含一个长为195bp的ORF框。利用BLAST程序进行核苷酸序列比对，发现与GenBank中鸭AvBD2的核苷酸序列有98%～100%的相似性，表明所克隆到的片段为鸭AvBD2基因序列。利用信号肽分析软件对ORF框信号肽序列进行分析（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／），得知信号肽裂解位点在22与23位氨基酸之间，即：-GLS-LP-间（见图3）。以编码区序列进行BLAST，发现同GenBank中已注册的鸭AvBD2基因相似性为98%与100%。相似性为100%的是中国品种鸭，相似性为98%的是国外品种鸭。差异表现为3个碱基的变化，分别是编码区98位碱基由A→T，136位碱基由A→G及150位碱基由C→T；导致有2个氨基酸的变化，即33位氨基酸由K→I，46位氨基酸由I→V。由于氨基酸的变异，导致分子量产生变化及pI值的变异。预测本研究克隆到的鸭AvBD2分子量大小为7334.93Da，pI值为9.09。Soman等［7］报道的国外品种鸭AvBD2其分子量大小为7305.89Da，pI值为8.81。

图3 鸭AvBD2基因测序结果与序列分析

2.3 鸭AvBD2基因的组织器官中分布 对1日龄与20日龄鸭17个组织器官该基因进行检测，结果为AvBD2基因在脾脏和肾脏中大量表达；心脏和肝脏中有少量表达；肺脏和骨髓有中等水平表达；在胸腺、腔上囊、小肠、胰腺、腺胃、食管、气管、舌头、胸肌、卵巢、皮肤中未见表达。结果见图4、图5。

图4 AvBD2基因组织器官RT-PCR扩增结果

图5 AvBD2基因组织器官RT-PCR扩增结果

3 讨论

通过RT-PCR技术，本研究克隆获得长为350 bp的鸭AvBD2基因。目前，在GenBank中公布的鸭AvBD2基因序列有3条，2条是国外品种，1条是国内品种。对成熟肽段核苷酸序列进行比对时发现，2个国外品种鸭的核苷酸序列完全相同，国内品种鸭的序列与本研究克隆到的序列也完全相同，但国内与国外品种鸭间有3个核苷酸的变化，导致2个氨基酸的变异。这种变化是物种在遗传选择过程中的自然选择所致，还是由于其他外部原因导致的，非常值得分析。尤其是这种差异表现在国内品种鸭与国外品种鸭之间，环境或疾病因素是否是导致序列发生变化的主要因素，这种变化对其生物学功能是否产生影响，值得研究。另外，这种变化在鸭其他种类β-防御素基因上是否也有，由于对鸭防御素基因研究还比较晚，上传序列少，没办法作出比较。因此还需要有更多的序列及其他种类防御素基因克隆出来以后，才能做出准确的判断。不过在对鸡AvBD-1基因的研究过程发现，AvBD-1有两种形式，即AvBD-1与AvBD-1（α）。它们之间的区别仅是基因序列上编码区3个碱基的不同，导致3个氨基酸的变异，发生变异的AvBD-1称为AvBD-1（α）［10］。Harwig等［11］也从鸡异嗜性白细胞中分离纯化出这两种多肽，因此可以排除是等位基因。这两个基因高度的同源性表明这两个基因起源于一个关系非常近的复制子。这种现象在人α-防御素HNP-1与HNP-3之间也存在，这两个基因编码区核苷酸也只有2个不同，导致2个氨基酸发生改变，而且在整个基因全长（3.7kb）DNA序列上也只有17个核苷酸的差异，同样表明，这两个基因高度的同源性表明这两个基因起源于一个非常近的复制子［12］。现在情况是否与此相似，也有待于研究。

对鸭AvBD2在机体不同组织部位表达分布的研究结果表明，鸭AvBD2在1日龄与20日龄鸭的脾脏和肾脏组织中均大量表达，在骨髓中呈中等水平表达，在心脏和肝脏中仅少量表达，在其他组织器官中均未检测到有表达。与Soman等［5］的研究发现有所不同，他们的结果是鸭AvBD2在脾脏和骨髓中大量表达，腔上囊、卵巢、小肠也有少量表达。可能原因是与鸭品种不同相关。防御素基因在不同组织中的表达差异性，是与其功能相关的［13］。如鸡 AvBD5、AvBD9和AvBD10在小肠等消化系统组织中有一定量的表达，重组蛋白有抗大肠杆菌、猪致病性链球菌、金黄色葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌的活性［14-15］。本研究利用RT-PCR技术成功扩增到鸭AvBD2基因，为进一步对该基因的功能研究奠定基础。

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