环介导等温扩增技术快速检测猪细小病毒的试验

黄书林，付 萍，李佳禾，张跃伟，蒋 菲，张 侃，陈会玲，吴文学

（1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；2.中国牧工商（集团）总公司中牧研究院，北京 丰台 100070）

猪细小病毒病是由猪细小病毒（PPV）感染引起母猪繁殖障碍的重要病原体之一，主要引起母猪发生流产、死胎、畸形胎、木乃伊胎及不孕等。近年来，猪细小病毒病有上升的趋势，并且该病常常与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒，伪狂犬病病毒等发生混合感染，给养猪业造成巨大的损失［1-2］。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作为一种新兴的核酸扩增技术［3］，具有高特异性、高敏感性、快速、简便等优点［4-6］。本试验针对猪细小病毒NS-1基因设计引物，建立了猪细小病毒LAMP检测方法。

1 材料与方法

1.1 毒株及病料来源 猪细小病毒7909株、NADL-2株，购自中国兽医药品监察所；猪繁殖与呼吸综合征病毒标准株（VR-2332）、猪伪狂犬病病毒Bartha-K61株、猪瘟病毒（C株）、弓形虫（RH株）的核酸样品，由本实验室制备保存。疑似PPV感染流产胎儿组织病料采自北京周边地区、山东潍坊等地规模化猪场。

1.2 方法

1.2.1 核酸DNA的提取 采用基因组DNA提取试剂盒（TransGen）提取PPV 7909株、NADL-2株的细胞培养物和组织样本DNA，于-80℃保存备用。

1.2.2 LAMP引物的设计 在GenBank下载了NS-1基因全长序列，利用生物学软件DNAStar的MegAlign软件进行同源性比对分析，选取NS-1基因同源性高即保守区域，使用在线LAMP引物设计软件设计并筛选出PPV特异的6条引物（表1及图1）。

表1 所设计的引物

图1 猪细小病毒LAMP各引物的名称与顺序和各引物在基因组中对应的位置

1.2.3 LAMP反应的建立 参照日本荣研株式会社生产LAMP试剂盒，优化后的25μL反应体系为：4μL Tris-HCl（125mmol／L），2μL MgSO4（100mmol／L），2μL KCl（125mmol／L），2μL（NH4）2SO4（125mmol／L），0.4μL Betaine（50 mol／L），0.025μL 0.2%Tween 20，dNTPs（100 mmol／L）各0.3μL，12UBst DNA 聚合酶（New England Biolabs），此外，体系中引物 FIP（40 mmol／L）、BIP（40mmol／L）、F3（5mmol／L）、B3（5 mmol／L）、LF（20mmol／L）、LB（20mmol／L）各1 μL，2μL模板DNA，加双蒸水至25μL。

反应通过LA-200实时浊度仪（Teramecs，Japan）进行实时监测。反应产物若经2%琼脂糖凝胶电泳呈现典型“梯形”条带，则判定为阳性。置于LA-200实时浊度仪（日本）中63℃恒温反应，可实时监测反应液的浊度变化。以反应液浊度达到0.1判为阳性。反应45min结束，以检量曲线的形式展示反应结果。同时，反应产物还通过2%葡萄糖琼脂凝胶电泳进行检测。

1.2.4 PCR反应 以猪细小病毒NS-1基因（Gen-Bank登录号：NC-001718）为靶序列设计PCR引物。上游引物：5′-TAGGATGCGAGGAAAGAC-3′，下游引物：5′-GGAGTTAAGTGCAGGTTG-3′，扩增产物大小为400bp。25μL PCR反应体系，包括12.5μL 2xTaq PCR SuperMix（TransGen），上下游引物（25μmol／L）各0.6μL，2μL模板DNA，加双蒸水至25μL。反应条件为94℃预变性5min，之后94℃变性45s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸10min。通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应产物。

1.2.5 LAMP与PCR的敏感性 本试验针对LAMP和PCR检测的共同扩增区域序列构建重组质粒。以猪细小病毒NADL-2株DNA为模板，使用上述1.2.4中的PCR方法进行扩增反应。PCR反应产物（400bp）连接于pEASY-T1Cloning Vector载体（TransGen），构建含有目标片段的重组质粒，经分光光度计法测定并计算质粒的拷贝数浓度，进行10倍连续倍比稀释，使质粒在反应体系中的分布为106～100个拷贝／25μL，取一定量质粒，分别进行LAMP和PCR检测。

1.2.6 LAMP与PCR特异性 将猪繁殖与呼吸综合征病毒标准株（VR-2332）、猪伪狂犬病病毒Bartha-K61株、猪瘟病毒（猪瘟兔化弱毒株，C株）和弓形虫（RH株）作为模板，分别进行LAMP和PCR方法的特异性检测。

1.2.7 荧光指示剂的应用［4］将反应体系中加入含有0.625mmol／L钙黄绿素和 Mn2+3.75mmol／L的荧光指示剂2μL。将105.0TCID50／100μL的PPV 7909株细胞病毒液提取全基因组DNA作为模板，经63℃恒温反应45min，反应结束后观察溶液颜色变化。

1.2.8 临床样本检测 采集疑似病例的流产胎儿组织149份，-20℃保存。称取适量组织样本按w／v为1∶1加入0.9%氯化钠溶液，经研磨后，提取组织样本全基因组DNA。用已建立的LAMP和PCR方法检测，比较两种方法的阳性检出率。

2 结果与分析

2.1 LAMP和PCR的敏感性 设定反应产物浊度值超过0.1时，即作为阳性判定。敏感性试验显示，LAMP方法能在60min内检测出10个拷贝质粒（图2A），PCR方法仅能检测到103拷贝质粒（图2B）。表明建立的LAMP方法的检测极限高于PCR方法100倍。

2.2 LAMP与PCR的特异性 利用2株猪细小病毒和其他4株病原来检测LAMP和PCR方法的特异性。结果显示，两种方法能特异性扩增猪细小病毒两种毒株，而其他病原均无特异性扩增（图3）。表明两种方法都有很好的特异性。

2.3 荧光指示剂的应用 显色试验结果表明，在反应体系中加入含有钙黄绿素与Mn2+的作为荧光指示剂，阳性样品由棕黄色变为亮绿色，反应前后颜色变化及阴阳性对比明显，说明该荧光指示剂可用于判定LAMP反应结果（图4）。

图4 荧光指示剂在LAMP的可视化应用

2.4 临床样本的检测 用LAMP和PCR方法检测149份流产胎儿组织样本DNA。结果（表2）表明，LAMP方法阳性检出率22.1%（33／149），高于PCR方法的阳性检出率18.1%（27／149）。

表2 临床检测结果（n=149）

3 讨论

目前已有常规PCR、多重PCR、Real-time PCR和Nest-PCR等方法检测细小病毒，且多选择高度保守的NS-1基因作为检测的靶基因［7-8］。在本文中，我们同样选取了该基因上的保守区域设计了数套引物，并通过阴性和阳性筛选，获得1套高效、特异LAMP引物，建立了最佳反应体系。

试验发现，该方法能在63℃的恒温反应45min即可判定结果。敏感性试验表明，LAMP方法最低能检出10个拷贝数的PPV基因组，相当于0.1 TCID50／100μL，比常规PCR方法高100倍，与先前报道的该病原的LAMP方法灵敏度相当［8-9］。对多种病原基因组进行检测，无交叉反应，显示良好的特异性。此外，通过对149份临床样本检测，结果证明，LAMP的阳性检出率（22.1%）要高于PCR方法（18.1%），也进一步证明了LAMP具有更高的灵敏度。因此，可确定本试验建立的LAMP方法适用于PPV检测的高敏感性和特异性的方法。

为了避免气溶胶造成假阳性的问题，我们通过在反应前体系中加入钙黄绿素，反应结束后肉眼观察其颜色变化即可快速判定结果，这使得LAMP方法在临床检验上具有广阔的应用前景，为早期诊断、防制和净化提供了一种新方法。

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［5］李佳禾，李一婧，付萍，等.猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用［J］.农业生物技术学报，2009，17（6）：948-953.

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