不同程度奶牛乳腺炎IL-1βIL-6的试验

刘本君，张久丽，高 利，王洪伟，魏成威

（1.黑龙江科技职业学院动物医学学院，黑龙江 双城 150111；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

奶牛乳腺炎是指奶牛的乳腺组织内发生的不同程度的炎症，并伴有乳汁物理、化学及微生物学变化。它一般是由病原微生物感染、饲养管理、环境、遗传等因素综合作用引起的。乳腺炎的发生不仅使发情配种的时间延长，降低了奶牛的生产性能，而且还严重地影响了牛奶制品的品质，危及人类健康。

细胞因子是机体免疫系统的重要组成部分，具有调节多种细胞的生理功能。它们是细胞间相互沟通的桥梁之一，通常以网络的形式存在，并且相互影响，相互诱生，在机体炎症反应和免疫应答的过程中具有十分重要的作用。白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）是由Grey等人于1972年发现的一种能激活多种免疫细胞和炎症细胞的前炎性细胞因子。IL-1主要由单核-巨噬细胞和嗜中性粒细胞等产生的。根据其分子的结构和等电点不同，IL-1分为IL-1α和IL-1β，IL-1β具有广泛的生物活性，是体内作用最强的炎症介质之一。研究表明，IL-1β能够促进血管内皮-白细胞黏附分子的表达，趋化嗜中性粒细胞等炎性细胞进入机体病变部位，从而引起一系列炎症反应，其细胞因子mRNA的表达与炎症程度呈正相关，可作为临床上判断疾病严重程度和疗效的指标［1］。白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）是一种多功能的细胞因子，是由激活的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞等产生和分泌的一种糖蛋白。体内的多种细胞既能产生和释放IL-6，受到刺激后也能表达IL-6基因，因此说IL-6在免疫和炎症反应中发挥重要作用。IL-6能促进嗜中性粒细胞的活化和聚集，血清中IL-6水平可反应组织损伤程度［2］。IL-6表达失调与一些疾病的发生密切相关，在自身免疫性疾病、多发性骨髓瘤、骨质疏松症的病人中都出现IL-6的失控性表达［3］。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组 利用乳汁体细胞计数仪检测法对阿城区某奶牛示范基地的40头试验奶牛进行分组，要求全部奶牛年龄和泌乳期相近，分为C组（SCC＜50万个／mL）、Ⅰ组（50万个／mL＜SCC＜150万个／mL）、Ⅱ组（150万个／mL＜SCC＜500万个／mL）、Ⅲ组（SCC＞500万个／mL）。

1.2 样品采集

1.2.1 血样的采集 颈静脉采集C组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组各10头奶牛的血液，采样前消毒取血部位，对每头牛约取15mL的血液，将采集的血样室温下静止。

1.2.2 乳样的采集 采集C组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组各10头奶牛的乳汁，采样前对乳区进行清洗，然后用70%酒精消毒乳区，弃掉头2把乳汁，进行全天采样，从早上6点开始，每间隔5h进行取样，取样3次，每次20mL，最后混入无菌奶瓶中。将采集的乳样放到有冰块的泡沫箱中，将乳样带回东北农业大学病理实验室检测。

1.3 样品处理与测定

1.3.1 血样的处理及测定 颈静脉采集血液，在室温下，一般要求不超过20℃，自然凝固1～2h，冰浴30min，然后3000r／min离心10min，分离血清，4℃保存，待测。如检测时间较长，要将样品置于-80℃冰箱中保存备用。样品采用北京华英生物技术研究所IL-1β、IL-6放免试剂盒进行测定。

1.3.2 乳样的处理及测定 将乳样3000r／min离心5min，除去上层乳脂，然后于16000r／min高速离心机中离心10min，去除沉淀，保留上清，4℃保存，待测。如检测时间较长，要将样品置于-80℃冰箱中保存备用。样品采用北京华英生物技术研究所IL-1β、IL-6放免试剂盒进行测定。

1.4 数据分析 利用软件SPSS 13.0统计分析进行分析处理，数据用SD表示。

2 结果

表1 血清各组中IL-1β、IL-6含量

图1 血清各组中IL-1β含量

图2 血清各组中IL-6含量

表2 乳清各组中IL-1β、IL-6含量

图3 乳清各组中IL-1β含量

图4 乳清各组中IL-6含量

3 讨论

奶牛的乳腺是机体内一个复杂生物反应器，在乳腺内部，众多的保护因子包括细胞因子、抗体、激素、酶和神经递质等一起构建了多条错综复杂的信号通路，这些因子之间的动态平衡是维持乳腺健康的基本条件。当奶牛乳腺发生炎症时，机体抵抗力下降，体内细胞因子及其受体的表达就会发生异常［4］。因此，重视对细胞因子及其受体的检测，对研究细胞因子在乳腺炎症反应中的平衡十分必要。

IL-1β作为炎症和免疫源性的细胞因子，参与体内多种炎症反应。在正常情况下，血液中IL-1β的含量很低，但是在理化和生物等因素的诱导下，单核-巨噬细胞、淋巴细胞等均能表达及释放IL-1β，并在体内发挥多种生物学效应。本试验结果显示，血清和乳清中IL-1β的含量与C组比较，Ⅰ组IL-1β的含量无显著变化（P＞0.05），Ⅱ组、Ⅲ组IL-1β的含量极显著升高（P＜0.01），这与 Wenz等报道的IL-1β随奶牛乳腺炎程度的增加而增加相一致［5］。IL-1β是炎症反应早期最具影响的介质之一［6］，因此能较早而敏感的反映出组织损伤的程度。当奶牛发生乳腺炎症后，主要表现为炎区周围嗜中性粒细胞的浸润并释放细胞因子，同时微循环出现损伤。随着炎症的加剧，IL-1β的产生和释放也逐渐增加，当出现明显的临床症状时含量有所减少，但仍然高于对照组。主要原因可能是因为IL-1β是急性期反应的主要诱导物，待炎症发生后在体内的含量也逐渐降低。另外，到了炎症后期TNF-α的大量分泌对IL-1β分泌也起到一定的抑制作用。

IL-6是炎症细胞因子网络中的重要组成成分，与体内感染性疾病的发生和发展密切相关。有研究表明，奶牛乳腺炎的发生和临床症状与细胞因子有关，乳腺炎急性期反应就是由IL-6和TNF-α等细胞因子激发和介导。本试验结果显示，血清中IL-6的含量与C组比较，Ⅰ组IL-6的含量无显著变化（P＞0.05），Ⅱ组、Ⅲ组IL-6的含量极显著升高（P＜0.01）；乳清中IL-6的含量与C组比较，Ⅰ组IL-6的含量显著升高（P＜0.01或P＜0.05），Ⅱ组、Ⅲ组IL-6的含量极显著升高（P＜0.01）。IL-6是一种迟发性细胞因子，能催化和放大炎性反应，随着炎症的加剧体内IL-6含量也增加，主要是奶牛乳腺发生炎症后，炎症刺激乳房局部的巨噬细胞和上皮细胞，使乳汁中IL-6含量增加。与此同时，炎症激活机体免疫功能，血液中的淋巴细胞被活化后IL-6等炎性反应因子分泌合成功能增强，于是血液中IL-6含量也增加。另外体内IL-1和TNF-α的增加也可促进IL-6的产生［7］。Hagiwara K 等［8］研究表明，患急性乳腺炎奶牛乳清与血清中IL-6的含量高低，与乳腺炎发病程度及恢复情况有着线性关系，可以成为治疗乳腺炎效果的指标。

不同程度乳腺炎乳汁中IL-6的活性随着乳腺炎的严重程度的增加而呈递增趋势，均高于C组，但Ⅰ组血清中的IL-6含量与对照组无显著变化，不具备乳腺炎的评价。不同程度乳腺炎血液中和乳汁中IL-1β的活性均随着乳腺炎的严重程度的增加而呈递增趋势，表现为先升高后降低，不具备评价乳腺炎的价值。由此可知，奶牛血清和乳清中的IL-1β、IL-6的含量与奶牛乳腺是否发生炎症反应以及奶牛机体的免疫状态密切相关，并且乳汁中的IL-6可作为奶牛乳腺炎诊断指标。

［1］Christman J W，Sadikot R T，Blackwell T S.The Role of Nuclear Factor-Kappa B in Pulmonary Diseases［J］.Chest，2000，117（5）：1482-1487.

［2］杨沛，陈伟，文爱清.联合检测血清Lipase、CRP和IL-6在急性胰腺炎诊断和预后判断中的价值［J］.重庆医学，2002，31（11）：1048.

［3］陈小奇.白细胞介素-6与2型糖尿病发生的研究进展［J］.国外医学：分子生物学分册，2002，24（2）：108-110.

［4］Riollet C，Rainard P，Poutrela B.Cell subpopulations and cytokine expression in cow milk in response to chronic Staphylococcus aureus infection［J］.J Dairy Sci，2001，84（5）：1077-1084.

［5］Wenz J R，Fox L K，Muller F J，et al.Factors associated with concentrations of select cytokine and acute phase proteins in dairy cows with naturally occurring clinical mastitis［J］.J Dairy Sci，2010，93：2458-2470.

［6］Rezamand P，McGuire M A.Effects of trans fatty acids on markers of inflammation in bovine mammary epithelial cells［J］.J Dairy Sci，2011，94：316-320.

［7］吴朝栋.内毒素诱生的细胞因子及其作用研究进展［J］.国外医学：免疫学分册，1995，3（1）：11-14.

［8］Hagiwara K，Yamanaka H，Hisaeda K，et al.Concentration of IL-6in serum and whey from healthy and mastitic cows［J］.Vet Res Commun，2001，25（2）：99-108.