检测猪戊型肝炎病毒的荧光定量PCR方法的建立

张亮权，欧阳昀，刘志刚，曹宗喜，闫明菲，王文华，郭泗虎，张桂红

（华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

戊型肝炎（hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的一种经粪口途径传播的人兽共患病。从1955～1956年在印度新德里［1］第一次HE大暴发至今，HE已广泛分布于亚洲、非洲及中美洲等发展中国家。新疆是我国HE的高发地区，曾在1986～1988年间暴发该病，是世界上一次大规模的流行，共计发病119280例，死亡707例［2］。

1997年Meng等［3］从猪体内分离出1株野生型HEV，发现其与人类的HEV有极高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴，因此推测猪可能是HEV感染的一个动物宿主。目前研究表明，HEV在猪群中普遍存在，已经被世界卫生组织认定是发展中国家的一个重要公共卫生问题。因此，对猪源戊型肝炎（swHE）诊断方法的研究十分必要。而荧光定量PCR（Real-time PCR）具有快速、灵敏、特异等特点，适用于swHEV的检测，本试验就建立了检测猪群中HEV的荧光定量PCR方法。

1 材料与方法

1.1 病毒与样品来源 猪源戊型肝炎病毒（swHEV），猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、圆环病毒2型（PCV2）、猪流感病毒（H1、H3亚型SIV）均由本研究室分离保存；16份胆汁样品采集于广东省某兽医院。

1.2 主要试剂和仪器 AMV反转录酶，Ex Taq DNA聚合酶，pMDl8-T载体［宝生物工程（大连）有限公司］；SYBR qPCR MIX（TOYOBO公司）；荧光定量PCR仪（ABI PRISM 7500型）。

1.3 引物的设计和合成 根据GenBank中swHEV ORF2核苷酸序列的保守区域，应用Primer premier 5.0设计了一对引物并由Invitrogen公司合成，预期扩增片段为126bp。上游引物：5′-CAGAATTGATTTCGTCGG-3′；下游引物：5′-TAGCTATACCCTTGTCCTGCTG-3′。

1.4 样品的处理 胆汁样品用灭菌PBS配成10%的悬浮液，4℃～8000r／min离心10min，取上清，-40℃保存。

1.5 病毒RNA的提取与cDNA的合成 按Invitrogen公司TRIzol®Reagent RNA提取试剂盒的使用说明进行总RNA的抽提，用AMV逆转录酶将总RNA逆转录成cDNA，置-20℃保存。

1.6 标准阳性质粒的制备 以cDNA为模板，用上述的1对特异性引物进行PCR扩增后，将回收纯化的PCR产物装入pMD18-T载体，经PCR和测序鉴定正确的阳性重组质粒命名为pMD-swHEV。用分光光度计测量阳性质粒的浓度，定量并稀释至1.0×109拷贝／μL，-20℃保存。

1.7 荧光定量PCR反应系统 荧光定量PCR反应总体积为20μL，其中SYBR qPCR MI×10μL，上、下游引物各0.8μL，模板1μL，灭菌去离子水补足。反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸35s并检测荧光，40个循环。

1.8 标准曲线的建立及稳定性分析 用灭菌去离子水将标准阳性质粒稀释成1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝／μL，作为模板进行荧光定量PCR，每个稀释度作3次重复。

1.9 特异性试验 分别以swHEV、PRRSV、FMDV、CSFV、PCV2、H1和 H3亚型SIV的DNA或cDNA为模板进行荧光定量PCR，并设立空白对照。

1.10 荧光定量PCR与逆转录巢式PCR（RT-nPCR）的比较分析 分别用荧光定量PCR与RT-nPCR［4］检测16份胆汁样品进行比较分析。

2 结果

2.1 标准曲线 建立的标准曲线的相关系数（r2）为0.998，以标准阳性质粒的拷贝数对数为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线（图1）：y=-3.039x+37.983。

图1 swHEV荧光定量PCR的标准曲线

2.2 稳定性分析结果 用8个不同稀释度的标准阳性质粒进行3组平行试验，Ct值变异系数（CV）在0.17%～1.41%之间（表1），显示出良好的重复性。

表1 荧光定量PCR的稳定性分析

2.3 特异性试验结果 从图2可知，对于swHEV出现了特异性的扩增曲线，CT值为25.09。而对于PRRSV、FMDV、CSFV、PCV2、H1亚型SIV、H3亚型SIV以及阴性对照，均没有产生荧光信号。

图2 荧光定量PCR的特异性分析

2.4 荧光定量PCR与RT-nPCR的比较分析结果 分别用荧光定量PCR与RT-nPCR检测16份胆汁样品，结果显示（表2），荧光定量PCR除了检测出RT-nPCR检出的7份阳性外，还检测出2份为阳性，RT-nPCR的最低检出浓度约为2.05×102拷贝／μL，而荧光定量PCR的最低检测浓度约为1.52×101拷贝／μL，表明荧光定量PCR的检测灵敏度比RT-nPCR约高10倍。

3 讨论

HE是一种能引起人和多种动物［3，5-6］感染的人兽共患病，人对HEV普遍易感，青壮年病死率可达1%～2%，孕妇病死率高达20%［7］。而猪感染HEV的现象普遍存在，因此，对swHEV诊断方法的研究具有重要的意义。

猪感染HEV后，很少有明显的临床症状［8］，这对swHEV的临床诊断带来很大的不便，需要进行实验室诊断。RT-nPCR是检测HEV核酸最常用的方法之一，然而swHEV病毒血症持续时间和粪便的排毒时间都很短，而且载毒量低，使该检测方法出现不稳定的现象。与RT-nPCR相比，荧光定量PCR具有更高的特异性和灵敏度，可作为swHEV的有效检测系统。

表2 荧光定量PCR与RT-nPCR的比较分析

本试验建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法灵敏度高，特异性强，并且具备良好的稳定性，适用于swHEV的检测，能为HEV的防治提供很好的技术支持。

［1］Wong D C，Purcell R H，Sreenivasan M A，et al.Epidemic and endemic hepatitis in India：evidence for a non-A，non-B hepatitis virus aetiology［J］.Lancet，1980，2（8200）：876-879.

［2］耿彦生，王佑春.戊型肝炎病毒感染免疫研究进展［J］.世界华人消化杂志，2010，18（9）：897-901.

［3］Meng X J，Robert H P，Pat rick G H，et al.A novel virus swine is closely related to the human hepatitis E virus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：9860-9865.

［4］刘志刚，曹宗喜，张得玉，等.广东地区猪源戊型肝炎病毒的检测和核苷酸序列分析［J］.黑龙江畜牧兽医，2011，9：94-96.

［5］Sun Z F，Larsen C T，Dunlop A，et al.Genetic identification of from healthy chicken flocks and characterization of the capsid from chickens with hepatitis splenomegaly syndrome in different United States［J］.J Gen Virol，2004，8（Pt3）：693-700.

［6］Okamoto H，Takahashi M，Nishizawa T，et al.Presence of antibodies to hepatitis E virus in Japanese pet cats［J］.Infection，2004，32（1）：57-58.

［7］Mushahwar I K.Hepatitis E virus：Molecular virology，clinical features，diagnosis，transmission，epidemiology，and prevention［J］.J Med Virol，2008，80（4）：646-658.

［8］Meng X J，Halbur P G，Haynes J S，et al.Experimental infection of pigs with the newly identified swine hepatitis E virus（swine HEV），but not with human strains of HEV［J］.Arch Virol，1998，143（7）：14052-14151.