HPLC 法测定复方银连颗粒中绿原酸的含量

夏 莲（广西北海食品药品检验所，北海市 536000）

复方银连颗粒是由金银花、连翘等多味中药组成的临床验方，具有清热、解毒、凉血的功效，临床用于治疗痤疮效果良好。原方以煎剂入药，笔者将其改成颗粒剂，既保持了煎剂吸收较快、作用迅速的优点，又克服了煎剂需临时煎煮、服用量大、携带储存不方便、久置易发霉变质等缺点。本试验采用高效液相色谱（HPLC）法，对复方银连颗粒君药金银花中有效成分绿原酸的含量进行了测定，以为该制剂的质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

Agilent1100型HPLC仪、8453紫外分光光度计（美国安捷伦公司）；LG16-W高速微量离心机（北京医用离心机厂）；SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵（2 800 r·min-1，巩义市英峪予华仪器厂）；BS224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；SB5200DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，工作频率：40 kHz，功率：200 W）。

绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110715-200815）；乙腈（色谱纯，天津市四有科技发展有限公司）；磷酸（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；复方银连颗粒（批号：100901、100903、100906）及其阴性对照颗粒（笔者自制）。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择

参照2010年版《中国药典》（一部）“金银花”项下绿原酸的测定条件[1]，并通过绿原酸对照品的紫外扫描结果，选择327 nm为检测波长。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Welchrom C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（10∶90）；检测波长：327 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行测定。结果表明，绿原酸峰与其他峰分离良好，阴性对照无干扰；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3 000。色谱见图1。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液 精密称取绿原酸对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含0.607 mg的对照品溶液。再精密量取0.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含151.75 μg的对照品溶液。再精密量取1 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含75.87 μg的对照品溶液，备用。

2.3.2 供试品溶液 取本品10 g，研细，取约1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加纯净水超声溶解，冷却至室温后定容，摇匀，即得。

2.3.3 阴性对照溶液 按处方量称取缺金银花的其他药材，制成缺绿原酸成分的阴性对照颗粒，并根据“2.3.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.4 线性关系考察

分别精密量取浓度为151.75 μg·mL-1的对照品溶液2、4、6、8、10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝2 970.3X+61.42（r＝0.999 6，n＝5）。结果表明，绿原酸进样量在0.303 5～1.517 5 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密量取浓度为75.87 μg·mL-1的对照品溶液10 μL，按上述色谱条件注入液相色谱仪，重复进样5次，记录峰面积。结果，平均峰面积为2 369.9，RSD＝1.72%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取复方银连颗粒细粉（批号：100901）适量，共6份，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果，样品中绿原酸的平均含量为1.520 mg·g-1，RSD＝2.37%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12 h进样10 μL，按上述色谱条件测定。结果，绿原酸峰面积的RSD＝1.15%（n＝5），表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的复方银连颗粒细粉（批号：100901）6份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.607 mg·mL-1的绿原酸对照品溶液1.2 mL，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

2.9 样品含量测定

分别取3批复方银连颗粒各10 g，研细，取约1 g，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定样品中绿原酸的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2Results of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

《中国药典》和某些文献采用不同比例的乙腈-0.4%磷酸溶液[1～5]作为流动相测定绿原酸的含量，但该流动相酸度较大，易损伤柱子，缩短柱子的寿命。因此，笔者通过参考文献[6，7]，采用乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90）作为流动相。结果表明，绿原酸的峰分离效果与峰形的对称性等方面与乙腈-0.4%磷酸溶液作流动相时比较无显著差异，故选择该系统作为流动相。

3.2 供试品溶液制备方法的选择

笔者曾对比乙醇超声提取法[5～10]和纯净水超声提取法对供试品制备的影响，结果表明，采用乙醇超声法制备供试品时，绿原酸的提取量仅约为纯净水超声法提取量的69%；同时曾采用乙酸乙酯萃取法[11，12]对供试品进行纯化，结果表明此法虽能除去部分杂质，但绿原酸损耗较高。综合考虑，选择纯净水超声提取法作为供试品的制备方法。

综上，本方法操作简便、可靠，可用于复方银连颗粒的质量控制。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：205-206.

[2] 张伟敏，蒲云峰，钟 耕.金银花中绿原酸的分析测定方法[J].中国食品添加剂分析测试，2005，9（25）：155.

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