慢性阻塞性肺疾病患者细胞凋亡和caspase-3的表达

梁宪梅,曾锦荣,夏春波

(1.广西省桂林市第二人民医院呼吸内科,广西桂林,541001;2.桂林医学院附属医院呼吸内科,广西桂林,541001;3.桂林医学院人体解剖学教研室,广西 桂林,541004)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系统常见疾病,具有较高的患病率和病死率,探讨COPD的发病机制和新型治法是目前研究的热点和难点[1]。COPD患者存在肺内细胞增殖和细胞死亡之间的平衡失调,细胞凋亡参与了COPD的发病过程[2]。半胱氨酸蛋白酶(caspase)在细胞凋亡中发挥重要作用,其中caspase-3的作用尤为突出。本研究通过检测COPD患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞凋亡以及caspase-3水平,进一步阐明细胞凋亡以及caspase-3与COPD发生发展的关系,并为发病机制和治疗方法的研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2005年2月～2009年7月本院就诊的COPD患者43例,诊断符合慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007修订版)[3],除外支气管扩张、肺结核等疾患。选择不吸烟COPD患者19例为不吸烟组,男11例,女8例,平均年龄63.8岁,平均病程5.4年;选择吸烟COPD患者24例为吸烟组,男21例,女3例,平均年龄62.7岁,平均病程5.9年。另选健康志愿者15例为对照组,男9例,女6例,均无慢性支气管炎、肺气肿、COPD、哮喘等呼吸系统疾病史,无吸烟史,近1月内无呼吸道感染史,胸片及肺功能检查均未见异常,所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

胎牛血清购自杭州四季青公司,细胞凋亡原位检测试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品。caspase-3 IgG购自Santa Cruz公司,工作浓度为1︰100。兔 SP检测试剂盒(SP-9001)及DAB显色试剂盒(ZLI-9032)均购自北京中衫金桥生物技术有限公司,T riton X-100购自Generay公司。

1.3 实验方法

1.3.1 支气管肺泡灌洗液收集、培养和细胞爬片:按文献方法[4]进行,纤维支气管镜经鼻腔进入后予20 g/L利多卡因5 mL行常规局麻,快速注入37℃注射用生理盐水50 mL×3次,并立即回抽液体至硅化的塑料容器内,回收的BALF放4℃保温桶并立即送实验室处理。用2层无菌纱布过滤BALF后,于低温离心机离心10 min,将细胞成分用含胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素1×105U/L、链霉素0.5×105U/L)培养,调整细胞浓度为5×109/L,将上述细胞悬液接种至预先放有盖玻片的培养板中,置37℃、5%CO2的培养箱中贴壁2 h,吸出上清液,PBS轻轻漂洗,去掉未贴壁细胞,将细胞爬片取出,4%的多聚甲醛固定10 min,-20℃冰箱备用。

1.3.2 TUNEL法检测细胞凋亡:细胞凋亡检测采用T UNEL技术,严格按照说明书进行,以50 μ L标记液(不含末端转换酶)代替 TUNEL反应混和液做阴性对照。细胞凋亡阳性判断标准:细胞核内出现棕黑色或黑色颗粒为阳性细胞。计算方法:选择5个以上具有代表性的高倍视野(×400),计数500个TUNEL染色阳性的细胞数即细胞凋亡数。凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.3.3 免疫细胞化学(SP)法检测caspase-3表达:用3%H2O2 50 μ L处理10 min以阻断内源性过氧化物酶活性,PBS冲洗,加1%Triton X-100处理10 min,PBS冲洗,加入正常山羊血清工作液封闭20 min,倾去血清,滴加caspase-3一抗(1∶100)50 μ L,4 ℃过夜,PBS 冲洗 ,加入生物素标记二抗工作液50 μ L,37℃孵育40 min,PBS冲洗,加辣根酶标记链霉卵白素工作液50 μ L,37℃孵育40 min,PBS冲洗,加新鲜配置的DAB工作液100 μ L显色,以镜下观察为准,自来水冲洗 2 min终止反应,并复染、分色、返蓝、脱水、透明、中性树胶封片,镜下观察和照相。设0.01 MPBS代替一抗的阴性对照。结果评分:随机取10个高倍镜视野,每个视野计数100个细胞,以胞质出现棕黄色颗粒者为阳性细胞,以阳性细胞数低于细胞总数的5%为0分,5%～25%为1分,25%～50%为2分,50%～75%为3分,大于75%为4分。另一方面按阳性细胞中染色的强度积分,弱阳性为 1分,中等阳性为2分,强阳性为3分,将阳性细胞数积分与染色强度积分相加即为caspase-3表达水平。

2 结 果

2.1 COPD支气管肺泡灌洗液病理学变化

细胞爬片经常规HE染色结果显示,与对照组比较,吸烟组和不吸烟组均有较多的炎性细胞,其中以中性粒细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞多见。

2.2 COPD支气管肺泡灌洗液细胞凋亡检测

在光学显微镜下,可观察到对照组、吸烟组和不吸烟组的凋亡细胞常单个散在分布,表现为核染色质致密浓缩,边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状等典型的凋亡形态。吸烟组和不吸烟组的凋亡指数分别为(31.22±8.45)、(29.30±7.11),与对照组比较,均有显著性差异(P<0.01)。吸烟组和不吸烟组BALF的细胞凋亡指数无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.3 caspase-3在COPD支气管肺泡灌洗液中的表达

免疫细胞化学结果显示,caspase-3蛋白表达阳性染色主要位于细胞浆中,为粗细不一的棕黄色颗粒,吸烟组和不吸烟组的阳性细胞多呈弥漫性分布,正常对照组呈阴性或弱阳性表达。吸烟组和不吸烟组caspase-3表达积分分别为(5.74±1.83)、(5.39±1.26),与对照组比较,均有显著性差异(P<0.01)。caspase-3蛋白在吸烟组和不吸烟组BALF中的表达积分无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 C OPD支气管肺泡灌洗液细胞凋亡和caspase-3表达比较(±s)

表1 C OPD支气管肺泡灌洗液细胞凋亡和caspase-3表达比较(±s)

与对照组比较,＊＊P<0.01。

组别 n 凋亡指数 caspase-3表达积分对照组 15 5.46±1.37 1.12±0.60不吸烟组 19 29.30±7.11＊＊ 5.39±1.26＊＊吸烟组 24 31.22±8.45＊＊ 5.74±1.83＊＊

3 讨 论

COPD发病机制复杂,目前对其本质还未完全认识,可能与氧化应激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、细胞因子、炎性介质等有关[5-6]。近年来,随着对细胞凋亡通路基因调控研究的不断深入,细胞凋亡与COPD发生发展关系的研究越来越受到人们的关注。有研究表明COPD患者存在着不同程度的肺实质细胞破坏、消失,炎细胞浸润及气道、血管结构重建[7],这表明COPD患者存在着肺内细胞增殖和细胞死亡的平衡失调。杨中飞等[8]研究结果显示,COPD患者肺内肺泡上皮细胞和血管平滑肌细胞均存在不同程度的增殖、凋亡。肺泡上皮细胞凋亡、血管平滑肌增殖处于主导地位,其增殖凋亡的失衡可能在COPD发病进程中起一定作用。对支气管肺泡灌洗液检测结果显示,COPD患者的凋亡指数明显高于健康对照组(P<0.01),提示细胞凋亡可能是COPD发生发展的重要因素之一。另有报道,COPD患者肺内存在炎性细胞凋亡异常,肺泡巨噬细胞可应激性激活肺泡细胞产生炎症导致炎性细胞浸润,并最终导致肺气肿的发展[9]。

凋亡或称程序性细胞死亡(PCD)是由基因控制的细胞自主的有序细胞死亡,它的中心执行者是caspases家族,它的激活及调控在凋亡过程中发挥着极为重要的作用。caspase-3是参与细胞凋亡的caspase级联反应的最终效应子,在蛋白酶级联切割过程中处于核心位置。本研究结果显示,COPD患者caspase-3表达积分均高于正常健康对照组(P<0.01),推测caspase-3在COPD患者支气管肺泡灌洗液中发挥了重要作用,出现了细胞增殖和凋亡的失衡,最终导致COPD的发生发展。目前,COPD细胞凋亡机制尚未明确,可能与患者循环血中存在的凋亡调节因子异常有关,COPD线粒体发挥关键作用的是调节凋亡和释放凋亡介质如细胞色素C等,细胞色素C从线粒体释放出来,与凋亡蛋白酶激活因子-1和caspase-9结合,激活caspase-9,导致caspase-3的活化及随后的细胞凋亡[10]。

长期吸烟是COPD的重要诱因,有报道显示,吸烟与肺细胞氧化应激、细胞凋亡和基因表达密切相关[11]。Husari等[12]在探索COPD巨噬细胞凋亡的胞内机制时观察到线粒体膜电位的破坏,细胞色素C的释放,但并未发现caspase活化,即使采用数种caspase阻断剂也不能抑制细胞凋亡,认为香烟诱导巨噬细胞凋亡的机制与caspase无关。另有报道,在人支气管上皮细胞和孤立的线粒体,香烟烟雾提取物(CSE)接触导致剂量依赖性抑制作用的同时,降低线粒体膜膜电位,增加线粒体氧耗,CSE可诱导caspase-3和caspase-7活动和诱导上皮细胞凋亡到坏死,诱导线粒体功能紊乱[13]。本组研究发现,吸烟组细胞凋亡指数和caspase-3表达积分与不吸烟组均无显著性差异(P>0.05),可能与吸烟量、吸烟时间及COPD伴发疾病等有关,其机制有待进一步研究。

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