消化道肿瘤患者血清TK1的表达及临床意义

徐利本,沈丽琴,庄志祥

(苏州大学第二附属医院肿瘤科,江苏苏州,215004)

肿瘤是当今世界严重威胁人类健康和生命的一种细胞异常增殖性的恶性疾病。肿瘤标志物的研究成为当今肿瘤研究的热点之一。胸苷激酶1(thymidine kinase1,TK1)是与细胞DNA合成与增殖密切相关的关键酶,在非增殖细胞和健康人血清中,含量极微或检测不到,但在恶性肿瘤患者中伴随着肿瘤细胞的急剧增殖而升高[1],在全身脏器肿瘤的发生发展及其预后中的作用也逐渐受到关注。TK1是嘧啶补救合成途径的关键酶之一,是一种与细胞增殖密切相关的新的细胞周期类增殖标记物[2-3],与患者的肿瘤类型,肿瘤生长快慢程度以及肿瘤分期[4]有关。本试验利用免疫印迹增强化学发光法(ECLA)对消化道肿瘤患者和健康人血清TK1(STK1)水平进行检测,研究评价TK1的表达,联合检测消化道肿瘤标记物CEA、CA199能否提高其在诊治中的临床价值,观察其在消化道肿瘤患者的早期筛查、临床分期、疗效评价和预后方面的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2009年09月～2011年2月份苏州大学附属第二医院消化道恶性肿瘤患者(所有病例均经病理学检查证实)治疗前后血清标本各150例,其中食道癌 20例(男13例、女 7例、40～75岁、中位年龄57岁)、胃癌 60例(男 45例、女15例、22～85岁、中位年龄 60岁)、结直肠癌40例(男24例、女16例、30～76岁、中位年龄54岁)、其他恶性肿瘤 30例(男17例、女 13例、43～78岁、中位年龄61岁),进行STK1水平测定。正常对照组为本院体检中心健康人群40例(男22例、女18例、28～73岁、中位年龄 52岁),正常对照组应该排除(贫血、女性月经期等处于细胞增殖状态之外的健康人)上述标本收集均经医学伦理委员会同意。

1.2 仪器和试剂

TK1诊断试剂盒主要有以下组成:硝酸纤维素薄膜,anti-TK1 A b,TK 标准品(2.2、6.6、20 pmol/L),ECL试剂。生物素化二抗,辣根过氧化物酶标记亲和素,封闭剂,抗体稀释液,抗体洗涤液。CIS-I型化学发光数字成像分析仪。试剂及仪器均(深圳华瑞同康公司)提供。Heraeus离心机购自上海纳锘有限公司。以上操作严格按说明书进行。

1.3 方法和步骤

1.3.1 标本收集:消化道肿瘤治疗前后及对照组空腹采集2份静脉血各2 mL,分别用干燥管收集血液(禁抗凝剂和促凝剂)待血液自然凝固后,1份行常规血清CEA、CA19-9检测,另1份行 TK-1检测,方法:3 000～4 000 r/min,离心 5～10 min取上清直接点样或取100～200 μ L血清分装于两个洁净的EP管中并编号(1管用于检测、另1管用于复检),保存在-20℃以下待检。

1.3.2 检测步骤:根据试剂盒说明书配制pH为7.6抗体稀释液,洗液和封闭剂;根据人份选择模板的大小,在A1、A2、A3按顺序点上标准品1、标准品2、和标准品3、待测样品按顺序点在后面的空上,室温下晾干20～30 min;在反应盒内用稀释液振摇洗膜2次,5 min/次;稀释后加入一抗,在25℃下振摇反应2 h;先用洗液快速漂洗2次后,振摇洗3次,5 min/次;再加生物素化二抗后室温下振摇反应40 min,洗涤;按1:10 000稀释链酶亲核素-酶复合物室温精确反应1 h,洗涤;加入ECL发光剂,过膜浸湿并精确反应1 min,将膜片用吸水纸吸干,然后放入塑料膜内挤干剩余的溶液;将膜放入CIS2Ⅰ型化学发光成像分析系统内进行分析。癌胚抗原(CEA)采用酶免疫测定法,在BECK MAN DXi800测定仪上测定。糖抗原(CA199)采用化学发光法,在ROCHE 2010化学发光仪上测定。

1.4 评价指标

TK1>2 pm/L 、CEA ≥6.5 μ g/L 、CA199 ≥37 U/mL判断为阳性结果。敏感性(SE)=[真阳性样本数(真阳性样本数+假阴性样本数)]×100%;特异性(SP)=[真阴性样本数/(真阴性样本数+假阳性样本数)]×100%。

2 结 果

2.1 肿瘤患者与正常人比较

肿瘤患者150例,STK1浓度范围为(2.54±2.08)pmol/L,健康人40例,其STK1浓度围为(1.20±0.89)pmol/L,肿瘤患者明显高于健康人群,2者比较有明显的统计学意义(P<0.01),如表1。

表1 正常人STK1值与消化道肿瘤患者STK1值比较(±s)

表1 正常人STK1值与消化道肿瘤患者STK1值比较(±s)

与健康对照组比较,＊＊P<0.01。

组别 n STK1值(pmol/L)健康对照组 40 1.20±0.89肿瘤患者组 150 2.54±2.08＊＊

2.2 外周血STK1在消化道肿瘤患者和健康人群中的阳性检出率及联合检出率

STK1阳性率与CA199、CEA 2者阳性率比较有统计学意义(P<0.01)。STK1+CEA+CA199联合检验与单独行STK1,CEA、CA199检测比较提高了近30%,有明显统计学意义(P<0.05)。STK1的敏感度为55%,特异度为87.5%。

表2 患者STK1、CEA、CA199敏感性(阳性率)及联合检测的比较[%]

2.3 肿瘤患者经治疗前与临床分期的关系

消化道肿瘤患者未治疗分成2组,Ⅰ～Ⅱ期患者67例,STK1平均值为(2.15±1.79)pmol/L。Ⅲ～Ⅳ期患者83例STK1平均值为(2.85±2.23)。2者比较有明显差异(P<0.05)。

表3 消化道肿瘤患者治疗后不同分期的STK1值(pmol/L,±s)

表3 消化道肿瘤患者治疗后不同分期的STK1值(pmol/L,±s)

与Ⅰ～Ⅱ期患者比较,＊P<0.05

分期 n STK1值Ⅰ～Ⅱ 67 2.15±1.79Ⅲ～ Ⅳ 83 2.85±2.23＊

2.4 可评价肿瘤患者STK1值与临床疗效的关系

患者经过手术、化疗、放疗、生物治疗等不同治疗手段后,选取可评价患者105例。其中CR 9例、PR 11例、PD 44例治疗前后有统计学差异(P<0.01),SD 41例治疗前后无明显改变。而且治疗后随病情的进展STK1值明显逐渐升高。

表4 临床疗效与消化道肿瘤可评价患者STK1值的关系(±s)

表4 临床疗效与消化道肿瘤可评价患者STK1值的关系(±s)

与同组治疗前比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01。与CR患者治疗后比较,#P<0.05,与PR患者治疗后比较,P<0.05。

临床疗效 n STK1(pmol/L)治疗前 治疗后CR 9 1.62±0.39 0.98±0.45＊＊PR 11 2.07±0.69 1.30±0.54＊＊SD 41 1.76±1.12 2.18±1.47#PD 44 2.20±1.35 3.27±2.64＊#

3 讨 论

随着人们生活水平提高,在绝大多数国家癌症均呈明显升趋势,已经成为致死的第一原因[5]。大多数患者被确诊为癌症时已是晚期,约30%患者已经出现癌转移。因而,发现患者是否进入转移阶段或是处于肿瘤早期对于指导抗癌治疗显得十分必要。虽然不同诊断技术层出不穷,如内镜活检、CT、PET和MR等,但使用其他的辅助诊断也十分必要。到目前为止已有一系列肿瘤标记物应用于临床中。

人类胸苷激酶(TK)是嘧啶合成的补救酶,催化胸苷磷酸化形成胸苷一磷酸,这种磷酸化作用是DNA代谢中的唯一途径。细胞中TK主要有两种同工酶:细胞质胸苷激酶(TK1)和线粒体胸苷激酶(TK2)。TK1基因定位于染色体17q13.2-25.3,靠近半乳糖激酶基因,是参与DNA合成的关键酶之一,为s期特殊酶。TK1水平取决于细胞的增殖度,是细胞周期依赖性标志物,在增殖细胞G1和s期交界处开始升高,直至s期达到高峰,在肿瘤细胞中这种高TK1水平从s晚期可持续到M早期,其浓度将伴随着肿瘤细胞的急剧增殖而升高,一旦癌变,TK1的活性和含量都将升高,可超过正常水平的2100倍,正常成人细胞中含量极低[4]。TK2的活性只有TK1的5%,在增殖细胞中含量很低。在乳腺癌和肺癌患者的研究中发现,STK1是个用于监测肿瘤治疗效果的有价值标记物[6-7]。

本实验肿瘤患者150例,STK1浓度为(2.54±2.08)pmol/L,健康人40例,STK1浓度为(1.20±0.89)pmol/L,肿瘤患者明显高于健康人群,2者比较有明显的统计学意义(P<0.01),敏感度为55%,特异性为87.5%,表明STK1对恶性肿瘤早期诊断具有较高的准确性。CEA、CA199是已经在临床中广泛使用的胃肠道血清肿瘤标记物,文献报道[8]CEA检测胃肠道肿瘤的阳性率为60%～90%。波动范围较大,本实验中阳性率为44%,低于文献报道,主要考虑为入组的病种较多,包括食管癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌等CEA检出率较低的病例。TK1与CEA、CA199两者阳性率相比,有统计学意义,联合检测后阳性率明显提高,达到73%,有较高的准确性,与诸多文献报道一致。由此可见,TK1在消化道肿瘤的诊断、病情监测、预后等方面可能优于其他消化道肿瘤标志物,具有一定的临床应用前景。研究发现TK1浓度是较其活性更为有用的标记物,比如,TK1的浓度可以用于对几乎所有实体肿瘤的检测[9],更具广谱性。

STK1不仅有高灵敏度,最近研究表明其对于肿瘤患者的治疗效果监控和疗效预后评估有重要的参考价值[10-11]。1692例乳腺癌患者的规范化临床试验研究显示[12],内分泌治疗后患者,细胞质胸苷激酶活性水平是与较短期生存率以及较差的疗效相关[13]。Li等[14]检测了250例非小细胞肺癌患者血清中TK1水平,大大高于正常对照组,且随肿瘤分期而增高,转移组显著高于未转移组。Zhang J等[15]对 56名膀胱癌患者的血清TK1含量进行了分析,发现膀胱癌患者血清TK1的含量明显高于正常对照组,并且TNM分期为Ⅲ期者明显高于I期,T2者明显高于T1者。本研究患者治疗后分成2组,Ⅲ～Ⅳ期患者STK1平均值明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者。。而且我们选取可评价患者105例进行分析:其中CR 9例,PR 11例,SD 41例,PD 44例。CR、PR、PD患者治疗前后比较有明显统计学意义,SD患者前后比较无统计学意义,且治疗后随病情的进展STK1值逐渐升高,也就是说与患者的治疗疗效之间有明显相关性,与文献报道一致。

综上所述,肿瘤患者外周血TK1的表达明显高于正常人,敏感度高,准确性好,血清TK1浓度监测对消化道肿瘤的诊断、疗效评估等均有一定意义,而与其他肿瘤标志物如CEA、CA199等联合使用,将更具临床意义。并且其表达水平与患者的临床分期、治疗疗效之间存在密切关系。TK1作为一种新的肿瘤标志物,有可能为肿瘤的早期诊断、疗效的监测、预后的判断带来新的曙光。

[1] Wu C,Yang R,Zhou J,et al.Production and characterization of novel chicken IgY antibody raised against C terminal peptide from human thymidine kinase1[J].J Immunol M et hods,2003,277(122):157.

[2] O'Neill K L,Buckwalter MR,M urray BK.Thymidine kinase diagnostic and prognostic potential[J].Expert Rev Mol Diagn,2001,1(4):428.

[3] Topolcan O,Holubec L Jr.The role of thymidine kinase in cancer diseases[J].Expert Opin Med Diagn,2008,2(2):129.

[4] 焦健华,黄霞玥,施瑞华.细胞质胸苷激酶TK1对结直肠癌术前诊断及术后随访价值的研究[J].实用临床医药杂志,2011,15(3):21.

[5] Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Estimation the world cancer burden:globocan 2000[J].Int J Cancer.,2001,94(1):153.

[6] Zhang F,Li H,Pendleton AR,et al.Thymidine kinase 1 immunoassay:a potential marker for breast cancer[J].Cancer Detect Prev,2001,25(1):8.

[7] Li HX,Zhang S,Lei DS,et a1.Serum thymidine 1 is a prognostic and monitoring factor in patients with non-small cell lung cancer[J].Oncology Reports,2005,13(1):145.

[8] 李允模,乔云飞.多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统在肺癌诊断中的临床意义[J].实用临床医药杂志,2010,14(24):1.

[9] He Q,Zhang P,Zou L,et al.Concentration of thymidine kinase1 in serum(S-TK1)is a more sensitive proliferation marker in human solid tumors than its activity[J].Oncol Reports,2005,14(4):1013.

[10] He Q,Mao Y,Wu J,et a1.Cytosolic thymidine kinase is a specific histopathologic tumoor marker for breast carcinomas[J].Int J Oncol,2004,25(4):945.

[11] Wang N,He Q,Skog S,et a1.Investigation on cell proliferation with a new antibody against thymidine kinase 1[J].Anal Cell Pathol,2001,23(1):11.

[12] Brot P,Romain S,Daver A,et al.Thymidine kinase as a proliferative marker:clinical relevance in 1692 primary breast cancer patients[J].J Clin Oncol,2001,19(11):2778.

[13] Foekens JA,Romain S,Look M,et al.Thymidine kinase and thymidylate synthase in advanced breast cancer:response to tamoxifen and chemotherapy[J].Cancer Res,2001,61(4):1421.

[14] Li HX,Lei DS,Wang XQ,et al.Serum thymidine kinase 1 is a prognostic and monitoring factor in patients with nonsmall cell lung cancer[J].Oncol Rep,2005,13(1):145.

[15] Zhang J,Jia Q,Zou S,et al.T hymidine kinase 1:a proliferation marker for deter mining prognosis and monitoring the surgical out-come of primary bladdercarcinoma patients[J].Oncol Rep,2006,15(2):455.