比较基因组杂交技术检测肝细胞癌染色体异常及其临床意义

肖开银 彭民浩 秦权林 桂文波 覃 晓 彭 涛 郭 雅 陈 滨 卢景宁 黎乐群

肝细胞癌(以下简称肝癌)是常见的肝脏恶性肿瘤，肝癌的发生是染色体不稳定性和畸变遗传积累的结果，肝癌染色体异常在癌前期即可出现，表现为超倍体。由于肝癌细胞培养技术复杂和染色体核型复杂，很难获得肝癌细胞的染色体中期分裂相，因此，传统的染色体显带技术及核型分析很难准确检测到肝癌细胞染色体异常。比较基因组杂交(CGH)技术采用基因组竞争性杂交技术，不受染色体断裂和细胞分裂相的影响，能准确检测肝癌细胞染色体的非平衡性异常，我们采用比较基因组杂交技术检测25例肝癌患者癌细胞染色体失衡情况，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 临床资料

收集我院手术切除的肝癌患者25例，术后病理均诊断为肝细胞癌，其中男23例，女2例，年龄23～65岁，中位年龄41岁。HBsAg阳性25例，AFP阳性21例，肿瘤平均(7.2±4.9)cm，合并肝硬化18例，合并癌栓9例，所有病例术前均未接受化疗或(和)放疗。

1.2 主要试剂和仪器

所有CGH试剂盒、男性健康人外周血淋巴细胞标准中期分裂相染色体和对照DNA(标记红色荧光SpectrumRed-dUTP)均购自美国Vysis公司，激光共聚焦显微镜、CCD冷光源、CGH分析软件均购自美国Apply Image公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA抽提 采用苯酚-氯仿-蛋白酶K方法提取基因组DNA。

1.3.2 CGH技术 用Nick Pranslation(DNA缺口平移法)制备肿瘤DNA探针，标记上绿色荧光 SpectrumGreen-dUTP，按试剂盒说明书操作，将肿瘤DNA、对照DNA和Cot-1DNA3种探针混合杂交于中期分裂相染色体，37℃避光孵育72h，洗片、封片后在激光共聚焦显微镜下观察染色体荧光分布。

1.3.3 CGH的质量控制 通过阳性DNA对照和阴性DNA对照评估实验是否成功。

1.3.4 CGH结果判断 染色体分裂相经摄取后在CGH软件进行染色体核型分析。每例患者选取5～10个高质量的染色体核分裂相，CGH软件自动分析每条染色体轴上红、绿两色荧光的强度和分布，计算每条染色体轴上绿/红两色荧光比率(FR值)，FR值在0.8～1.2之间为正常，＜0.8表示存在染色体DNA缺失(用“-”表示)，＞1.2表示存在染色体DNA拷贝数的扩增(用“+”表示)。

1.3.5 采用PCR-RFLP技术分别检测25例肝癌p53基因249密码子突变，13例(52%)存在G→T突变。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，检验方法用χ2检验、四格表确切概率法和相关性分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

本次CGH实验以1例已知染色体核型异常的病例作为阳性对照，以无染色体遗传及家族遗传病的正常女性作阴性对照，其CGH分析结果与已知的核型改变基本相符，结果可靠，合乎CGH质量控制的要求。

2.1 染色体扩增和缺失的区域

25例肝癌患者的CGH染色体荧光图像被分析软件登记注册，共分析了171个染色体分裂相7 492条染色体，每例5～10个分裂相，平均6.8个分裂相/例和300条染色体/例。染色体的变异涉及1～23对染色体，23例患者存在染色体DNA拷贝数的扩增，24例患者存在染色体DNA的缺失，主要和常见的染色体异常区域见表1。

表1 25例肝癌患者染色体扩增和缺失的区域

(续上表排版)

2.2 染色体扩增或缺失的频率

染色体变异最小的是 Chromosome 6p、12p和18q，90%以上的病例未发生上述染色体的扩增和缺失，变异最大的是 Chromosome 1p、2p和 4q，其中Chromosome 1p和2p以染色体DNA拷贝数扩增为主，Chromosome 1p扩增亚区主要集中在1q12～31(占94.4%，17/18)，4q以缺失改变为主;另外17q染色体变异全为扩增，16p染色体变异全为缺失。染色体变异频率＞25%的染色体见表2。

表2 25例肝癌患者染色体扩增或缺失的频率

2.3 与文献报道常见肝癌染色体变异比较

本研究结果与文献报道常见肝癌染色体变异比较结果见表3。

表3 本研究结果与文献报道常见肝癌染色体变异比较

2.4 染色体变异事件与临床指标的相关分析

25例肝癌全部获得3年随访，死亡11例，3年生存率56%，将上述染色体变异事件与临床指标作相关分析，临床指标赋值如下:

性别(男=1，女 =2)，年龄(≤40岁 =1，＞40岁=2)，肝硬化(是 =1，否 =2)，HBsAg(阳性 =1，阴性=2)，肿瘤大小(≤5cm=1，＞5cm=2)，p53 基因突变(是=1，否=2)，肝功能分级(A 级 =1，B 级 =2，C级=3)，AFP(阳性 =1，阴性 =2)，癌细胞分化程度(高分化 =1，低分化 =2)，癌栓(是 =1，否 =2)，3 年生存(生存=1，死亡 =2);染色体扩增/缺失(是=1，否=2)。结果见表4。

表4 染色体变异事件与临床指标的相关分析

表中只列出了检验有显著意义的染色体变异事件，无显著意义的染色体变异事件未列出。所有的染色体变异事件与性别、年龄、肝硬化有无、肝功能分级、甲胎蛋白等无相关性，+17p、-8p与癌细胞分化程度有关，+18p与肿瘤大小、癌栓、3年生存有关，-13q与3年生存有关，-11q与HBsAg、肿瘤大小、3年生存有关。

3 讨论

肝癌细胞存在明显的染色体异常，早在上世纪80年代美国Sandber实验室的科学家就在肝癌组织的渗出液细胞中观察到染色体数目的异常。虽然细胞培养和染色体显带技术已取得长足进步，但肝癌是实体肿瘤，很难制备出高质量的能够用于分析的中期染色体分裂相，在细胞涂片和染色时经常发生染色体的人为丢失和断裂，从而使核型分析更加困难并影响其准确性。上世纪末发展起来的CGH技术解决了这一难题，它不需要制备肿瘤细胞中期分裂相，只需要微量的肿瘤细胞DNA样本，一次实验即可检测全部染色体的非平衡性异常，对肿瘤细胞染色体DNA拷贝数的增加或扩增、缺失或删失作出判断，并进行定位。CGH是目前全球公认的检测实体瘤细胞染色体DNA异常的敏感技术，已广泛用于恶性肿瘤印记染色体的筛选和某些遗传性疾病基因的筛选和定位［1，5］。本研究采用CGH技术检测25例肝细胞癌的染色体异常，发现所有病例均存在不同程度的染色体变异，染色体变异涉及1～23对染色体，变异频率较小的染色体是6p、12p、18q，绝大多数病例没有检测到6p、12p、18q的扩增或缺失。染色体拷贝数扩增频率较高的是 1q(72.0%)、1p(64.0%)、2q(48.0%)、2p(48.0%)、5q(48.0%);染色体缺失频率较高的是4q(48.0%)、8p(40.0%)、17p(36.0%)，染色体扩增和缺失的频率与文献报道的结果相接近［1～4］。多数学者认为不同致癌原因和癌细胞分化程度的肝癌，其染色体异常有较大的差异性，这也是目前报道CGH检测染色体异常频率不同的原因之一［1］。通常认为，染色体DNA缺失的位点可能与抑癌基因缺失有关，而扩增的位点则与癌基因的激活复制有关。与肝癌发生密切相关的p53基因定位于17p上，是肿瘤抑制基因，其失活可导致肿瘤的发生，本研究也检测到17p缺失频率达36.0%，提示染色体变异位点可能存在于与肝癌发生发展有关的基因，我们还观察到-8q与癌细胞p53基因突变、-11q与HBV感染成负相关，显示两者之间具有一定的内在联系，其机制值得进一步探讨。国外有作者运用CGH技术，在酒精相关性肝癌中检测到高频率的8q扩增，认为+8q是此类疾病的特征［6］，而在亚硝胺致大鼠肝癌细胞中，-4q是较早期染色体变异事件［7］。CGH对肝细胞癌染色体异常的检测可为进一步寻找肝癌相关基因提供线索和定位方向，在扩增频率最高的1q21，有研究者分离出新的肿瘤基因ALC1，并鉴定ALC1的拷贝数扩增下调了p53基因的表达，成为致癌途径之一［8］。

肝癌的生物学行为常与肿瘤染色体异常有关，并进一步影响肝癌个体的治疗效果。有报道在肝细胞腺瘤、肝细胞非典型增生和高分化的肝细胞癌中，CGH检测染色体异常的频率分别为0%、53%和92%，从染色体变异水平解释肝细胞非典型增生容易发展成为肝癌，在有染色体变异的肝细胞非典型增生病例观察到复发和转移癌［9］，在分化良好的纤维板层型肝癌，存在染色体异常的患者5年生存率(33%)明显低于无染色体异常的患者(83%)［10］，此外还有很多学者报道了肝癌染色体变异事件与肿瘤生物学特性及预后的关系，但各家的报道均存在较大的差异，两个多中心的Meta分析(n=785和371)一致认为-13q与不良预后有关［1，2］，我们对染色体异常与性别、年龄、肝硬化有无、HBsAg感染、肿瘤大小，肝功能分级、AFP、癌细胞分化程度、癌栓和生存情况等临床指标作相关分析，结果也显示-13q与患者的3年生存成正相关，提示13q缺失是影响肝癌预后的独立指标;此外我们还发现+18p不仅与肿瘤的预后有关，还与肿瘤大小、癌栓有关，并可能通过肿瘤大小、癌栓等影响肿瘤预后;+17p、-8p则与癌细胞分化程度有关。

肿瘤的发生、发展与染色体的数量异常或(和)结构异常有密切关系，癌基因的激活和抑癌基因的失活是大多数肿瘤发生的主要机制，分析肝癌DNA的扩增或缺失为研究肝癌发生、发展的机制提供了有意义的线索，为筛选肝癌的易感基因提供了准确的定位信息。虽然肝癌的染色体变异发生率较高、变异较大，但在临床分析中，我们发现绝大多数的染色体异常事件与临床指标之间并无关联性，但+17p、+18p、-8p、-13q、-11q、-8q与肿瘤的生物学特性、预后有关，提示这些染色体异常在肝癌发生发展中是非随机事件，有待进一步研究和探讨。

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