聚合物纳米微球分离纯化格尔德霉素方法研究

李 宁，张雪霞，李晓露，王海燕，林 毅，蒋 沁

(微生物药物国家工程研究中心，河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄 050015)

格尔德霉素(Geldanamycin)属于苯醌安莎霉素类，它的结构特征是一个苯醌部分与一个平面性大环安莎桥相连[1]。具有抗原虫、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒以及免疫调节等多种生物活性。格尔德霉素通过特异性结合并抑制热休克蛋白90(Hsp90)，起到抑制肿瘤细胞和抗病毒的作用[2，3]。化学家们合成得到了一些具有较高抗肿瘤活性的格尔德霉素衍生物，已进入Ⅱ期临床试验，有望成为新的抗肿瘤药物[4]。

目前已知的格尔德霉素纯化方法[5]，多采用反复提取、树脂吸附、萃取、层析、结晶等过程，步骤繁琐，收率低。作者采用聚合物纳米微球对格尔德霉素发酵菌丝体的浸提浓缩物直接进行层析纯化，得到高纯度格尔德霉素，简化了工艺过程，提高了成品收率，质量可控，适于工业化生产。

1 实验

1.1 试药、试剂与仪器

格尔德霉素发酵液，华北制药新药公司。

格尔德霉素对照品，Sigma公司；聚合物纳米微球，苏州纳微科技公司；乙腈，色谱纯，Merck公司；双蒸馏水，自制；乙醇，国产分析纯。

中压层析系统(C-601泵，C-615控制器，C-616收集器，C-635检测器)，瑞士Büchi公司；高效液相色谱仪(515泵，2996检测器)，美国Waters公司。

1.2 发酵液预处理

格尔德霉素存在于菌丝体内。在发酵液中加入3%(质量体积比，g∶mL)的珍珠岩，搅拌30 min后过滤，水洗，得格尔德霉素菌丝体。向其中加入3倍(体积质量比，mL∶g，下同)95%乙醇，搅拌浸提1 h，过滤，得浸提液；向浸提后的菌丝体中再加入1倍95%乙醇，搅拌浸提1 h，过滤，得二次浸提液；合并浸提液，40 ℃减压浓缩至基本无乙醇流出，过滤，得深黄色固体，为格尔德霉素浸提浓缩物。

1.3 聚合物纳米微球层析条件的选择

装柱：取100 g聚合物纳米微球用0.1 mol·L-1的NaOH溶液浸泡2 h，水洗至中性，重力沉降法装柱(2.5 cm×30 cm)，用40%乙醇平衡系统。

1.3.1 聚合物纳米微球型号的筛选

分别用型号为PS30RPC、NM-MM100、PS/PVB300的聚合物纳米微球装柱，取0.8 g格尔德霉素浸提浓缩物用95%乙醇溶解后加样于层析柱，用120 mL 40%乙醇洗涤，然后用不同体积分数乙醇洗脱，洗脱速度5 mL·min-1，收集洗脱液，每管10 mL。HPLC检测分离效果，将格尔德霉素含量(面积归一法，下同)大于98.5%的接收液合并，计算洗脱收率。

1.3.2 洗脱液乙醇体积分数的选择

取0.8 g格尔德霉素浸提浓缩物用95%乙醇溶解后加样于PS30RPC聚合物纳米微球柱上，用40%乙醇洗涤层析柱，然后用不同体积分数乙醇洗脱，洗脱速度5 mL·min-1，通过中压层析色谱检测器在线监测，观察格尔德霉素主峰与杂质峰的分离效果。

1.3.3 洗脱速度的选择

取0.8 g格尔德霉素浸提浓缩物用95%乙醇溶解后加样于PS30RPC聚合物纳米微球柱上，用120 mL 40%乙醇洗涤，用65%乙醇作为洗脱剂，分别采用4 mL·min-1、5 mL·min-1、6 mL·min-1、7 mL·min-1、8 mL·min-1的洗脱速度进行洗脱，收集洗脱液，每管10 mL。HPLC检测分离效果，将格尔德霉素含量大于98.5%的接收液合并，计算洗脱收率。

1.3.4 加样量的选择

分别按照加样量(格尔德霉素浸提浓缩物与聚合物纳米微球质量比，g∶g，下同)为1∶150、1∶125、1∶100、1∶75、1∶50加样，用120 mL 40%乙醇洗涤层析柱，用65%乙醇洗脱，洗脱速度6 mL·min-1，收集洗脱液，每管10 mL。HPLC检测分离效果，将格尔德霉素含量大于98.5%的接收液合并，计算洗脱收率。

1.4 结晶

合并格尔德霉素含量大于98.5%的洗脱液，减压浓缩至基本无乙醇，5 ℃放置2 h，过滤，用水洗涤滤饼，真空干燥，得到格尔德霉素粉末。

1.5 HPLC色谱条件

色谱柱：Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温为室温；流动相为乙腈-水(70︰30)；流速1.0 mL·min-1；检测波长304 nm；进样量10 μL。

称取格尔德霉素对照品10 mg用流动相溶解，配制成约25 μg· mL-1的溶液。取对照品溶液10 μL注入色谱仪，按上述色谱条件外标法测定，以峰面积计算。该方法在格尔德霉素浓度为0.75～75 μg· mL-1时有良好线性关系(R=0.9999)；平均回收率(n=5) 为100.2%，RSD为0.37%。

2 结果与讨论

2.1 聚合物纳米微球层析条件的确定

2.1.1 聚合物纳米微球型号的确定(图1)

图1 不同型号聚合物纳米微球的洗脱收率

从图1可知，PS30RPC聚合物纳米微球在乙醇体积分数为60%、70%时对格尔德霉素的分离效果均较好，因此，选择PS30RPC聚合物纳米微球作为层析填料。

2.1.2 洗脱液乙醇体积分数的确定

通过中压层析色谱检测器在线监测发现，乙醇体积分数大于65%时，格尔德霉素洗脱过快，主峰与杂质峰不能有效分离；当乙醇体积分数小于65%时，色谱峰拖尾现象严重，且格尔德霉素洗脱速度大于杂质扩散速度，分离效果并没有提高。乙醇体积分数为65%时，格尔德霉素分离效果好、洗脱速度快。因此，选择洗脱液乙醇体积分数为65%。

2.1.3 洗脱速度的确定(图2)

图2 不同洗脱速度下的洗脱收率

从图2可知，洗脱速度为6.0 mL·min-1时，洗脱收率最高，因此，选择洗脱速度为6.0 mL·min-1。

2.1.4 加样量的确定(图3)

图3 不同加样量下的洗脱收率

从图3可知，在保证分离度的前提下，随着格尔德霉素加样量的增加，格尔德霉素的洗脱收率逐渐下降，当加样量超过1∶100时，洗脱收率显著下降，低于80%。片面地增加加样量，会导致上样过载，造成格尔德霉素与杂质的重叠，使格尔德霉素的洗脱收率降低。综合单批产量与产品回收率，选择加样量为1∶100。

2.2 工艺验证

确定聚合物纳米微球分离纯化格尔德霉素的工艺为：采用PS30RPC型聚合物纳米微球作为层析填料，格尔德霉素浸提浓缩物用95%乙醇溶解后加样于层析柱，用120 mL 40%乙醇洗涤后，65%乙醇洗脱，洗脱速度6.0 mL·min-1，加样量(样品∶填料，g∶g)为1∶100。经过5批中试放大，结果表明：PS30RPC型聚合物纳米微球可以很好地对格尔德霉素发酵菌丝体浸提物进行纯化，平均层析收率为92.5%，总平均收率为81.6%，平均成品纯度为98.7%。

3 结论

确定聚合物纳米微球分离纯化格尔德霉素工艺为：选择PS30RPC型聚合物纳米微球为层析填料，将格尔德霉素发酵菌丝体浸提物用95%乙醇溶解后加样于层析柱，用120 mL 40%乙醇洗涤，65%乙醇洗脱，洗脱速度6.0 mL·min-1，加样量(样品∶填料，g∶g)1∶100。此时，平均层析收率为92.5%、平均总收率为81.6%、平均成品纯度为98.7%。该分离纯化方法简便可靠，适于工业化生产。

[1] 廖志勇，甄永苏.热休克蛋白90抑制剂Geldanamycin的抗肿瘤作用研究进展[J].药学学报，2001，36(9)：716-720.

[2] Blagosklonny M V.Hsp-90-associated oncoproteins：Multiple targets of geldanamycin and its analogs[J].Leukemia，2002，16(4)：455-462.

[3] Chiosis G.Targeting chaperones in transformed systems—A focus on Hsp90 and cancer[J].Expert Opinion on Therapeutic Targets，2006，10(1)：37-50.

[4] Nowakowski G S，McCollum A K，Ames M M，et al.A phase I trial of 17-allylamino-17-demethoxy-geldanamycin in patients with advanced cancer[J].Clinical Cancer Research，2006，12(20)：6087-6093.

[5] 刘涛，屈凌波，李继安，等.格尔德霉素分离纯化工艺的研究[J].药物生物技术，2010，17(3)：247-250.