正交设计法优选土茯苓中落新妇苷及总黄酮的提取工艺

林耿丰，梁伟杰，肖凤霞，邓少东，邓超明，黎杏仪

（1.广东省中医院，广东 广州 510120；2.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006）

土茯苓是百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎，具有除湿、解毒、通利关节的功效。用于湿热淋浊、带下、痈肿、瘰疬、疥癣、梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛［1］。土茯苓中主要含黄酮类化合物，其中的主要成分落新妇苷具抗炎镇痛利尿之功效［2］，同时对于免疫性的肝损伤具有保护作用［3］，在2010版《中国药典》中作为土茯苓质量控制的指标性成分。土茯苓主产于广东、湖南、安徽、湖北、浙江、四川等省份，其中有许多代用品及混淆品。为了更好地控制该药材的质量，本文采用正交试验法研究土茯苓中落新妇苷和总黄酮的提取工艺，为科学评价该药材质量提供了依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

土茯苓药材产地分别为广东信宜、湖南、广西梧州、广西上思县、香港及越南河内；落新妇苷对照品（北京恒元启天化工技术研究院公司，批号：A0102），芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100080－200306）；甲醇（色谱纯，迪马公司，批号：50102），磷酸（分析纯，天津市福晨化学试剂厂，批号：20080427），甲醇（分析纯，天津市百世化工有限公司，批号：20100122），石油醚（分析纯，天津市百世化工有限公司，批号：20100126），无水乙醇（分析纯，天津市百世化工有限公司，批号：20100126），九水硝酸铝（分析纯，广东光华化学厂有限公司，批号：20071109），氢氧化钠（分析纯，天津市耀华化学试剂有限责任公司，批号：20060712），亚硝酸钠（分析纯，天津市福晨化学试剂厂，批号：20100115）；怡宝水。

1.2 仪器

天美高效液相色谱仪（LC2000紫外检测器，L－2200自动进样器，L－2130四元泵，T2000工作站）；GZX－DH 型电热恒温干燥箱（上海市跃进医疗器械一厂）；BP211D电子天平（德 国 Sartorious）；KQ－500型超声波清洗器（500W，40KHz，昆山市超声仪器有限公司）；H.H.S型电热恒温水浴锅（上海浦东跃欣科学仪器厂）；Cary 50型紫外可见分光光度计（美国瓦里安公司）。

2 方法与结果

2.1 落新妇苷的含量测定

2.1.1 正交实验设计

以落新妇苷含量为指标，选择甲醇用量（A）、提取次数（B）、提取时间（C）为考察因素，各设3个水平（见表1）。从实验结果（见表2、表3）可知，三种因素对落新妇苷含量没有统计学差异（P＞0.05），各因素影响顺序依次为B（提取次数）＞A（甲醇用量）＞C（提取时间），最后综合考虑各个因素，确定最佳提取工艺为加入甲醇30mL，超声提取15min，超声3次。

表1 落新妇苷提取因素水平

2.1.2 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈－0.1%磷酸水（21：79，v／v）；流速：1.0mL／min；检测波长：290nm；柱温：室温；进样量：10μL。

2.1.3 对照品溶液的制备

精密称取经110℃干燥至恒重的落新妇苷对照品适量，加甲醇制成100.6μg·mL－1的落新妇苷对照品溶液，作为对照品储备液。

表2 正交实验结果

表3 方差分析

2.1.4 供试品溶液的制备

取土茯苓粉末（过四号筛）0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇30mL，超声提取15min，提取3次，取出，放凉，滤过，用甲醇定容至100mL的容量瓶中，过0.45μm有机系滤膜，作为供试品溶液。

图1 落新妇苷对照品色谱

图2 供试品色谱

2.1.5 落新妇苷含量测定的方法学考察

标准曲线的制备。精密吸取落新妇苷对照品储备液0.25mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，4.0mL，5.0mL 置于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，备用。分别吸取上述系列溶液各10μL，按“2.1.2”项下色谱条件进样，以落新妇苷浓度（μg·mL－1）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得到的回归方程为：Y＝48125X＋5766.6（r＝0.9994）。其线性范围为2.515～50.3μg·mL－1。

精密度实验。吸取落新妇苷对照品溶液浓度为0.02012mg·mL－1，在上述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，结果落新妇苷峰面积的RSD为1.22%，证明精密度良好。

重复性实验。精密称取土茯苓粉末6份，每份0.2g，按照“2.1.4”项下的方法制备供试品溶液，并在上述色谱条件下进行分析测定，结果显示落新妇苷含量的RSD为2.1%，表明本方法的重复性良好。

稳定性实验。取同一供试品溶液，精密吸取10μL分别在0h，3h，6h，9h，12h各时间点进样分析，测定得落新妇苷峰面积的RSD为0.75%，表明供试品在12h内基本稳定。

回收率实验。精密称取已知含量（落新妇苷含量为8.6512mg／g）的土茯苓粉末6份，每份0.1g，分别精密加入0.0503mg／mL的对照品溶液1mL。按“2.1.4”项下的方法制备供试液，以上述色谱条件进样分析，计算回收率，结果见表4。

表4 加样回收率试验结果

2.1.6 样品测定

精密称取各产地的土茯苓粉末，按照“2.1.4”项下方法制成供试品溶液。在上述色谱条件下进样分析，测定峰面积，代入回归方程，计算出落新妇苷含量，测定结果见表5。

表5 样品测定结果

2.2 总黄酮的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取经110℃干燥至恒重的芦丁对照品适量，加50%乙醇制成433μg·mL－1的芦丁对照品溶液，作为对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取土茯苓粉末（过四号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入石油醚50mL超声提取（500W，40KHz）30min，取出，弃去石油醚液，待样品中残存的石油醚全部挥去后，按表6正交实验设计安排实验，加规定量的乙醇溶液后称定重量，超声提取规定的时间，取出，放凉，称重，用乙醇溶液补足减失的重量，滤过，取续滤液作为储备液备用。

表6 总黄酮提取正交实验因素与水平

2.2.3 测定波长的确定

取“2.2.1”项下芦丁对照储备液0.1mL，置于10mL容量瓶；加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加4%氢氧化钠溶液4.0mL，再加50%乙醇定容，摇匀，放置10min。置于比色皿中，以试剂空白作为参比，在波长250～600nm之间测定紫外吸收光谱。同法测定样品溶液在波长250～600nm之间紫外吸收光谱。根据对照品溶液和样品溶液的紫外吸收光谱确定最佳的测定波长为500nm，见图3。

图3 紫外吸收光谱

2.2.4 显色条件正交实验

取“2.2.1”项下芦丁对照储备液0.1mL，置10mL容量瓶中，按表7正交实验设计安排实验。加规定量5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min；加规定量10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6min；加规定量4%氢氧化钠溶液，再加规定体积分数的乙醇定容，摇匀，放置10min。置于比色皿中，以空白试剂作为参比，在波长500nm处测定吸光度。

表7 显色条件正交实验因素与水平 （mL）

2.2.5 正交实验结果分析

显色条件。由表8中可知，影响吸光度的主次因素依次为：4%氢氧化钠加入量＞5%亚硝酸钠加入量＞乙醇体积分数＞10%硝酸铝加入量，最佳的组合条件为A3B2C3D3，但综合提取工艺的正交分析选择A3B2C3D2为显色条件，即加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，加10%硝酸铝溶液0.3mL，加4%氢氧化钠溶液4.0mL，再加50%乙醇定容。

超声提取工艺的优化。采用所建立的紫外分光光度法测定总黄酮含量，并以其为分析指标，进行超声提取正交实验，结果与分析见表9。从表9可知，影响总黄酮含量的主次因素依次为料液比＞乙醇体积分数＞超声提取时间，其最佳工艺组合为A2B3C2，即用料液比为1∶50的50%乙醇在超声波的条件下提取60min。

表8 显色条件正交实验结果与分析

综上所得，样品的前处理及测定方法：取土茯苓粉末（过四号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入石油醚50mL超声提取（500W，40kHz）30min，取出，弃去石油醚液，待样品中残存的石油醚全部挥去后，加50%乙醇溶液50mL后称定重量，超声提取60min，取出，放凉，称重，用50%乙醇溶液补足减失的重量，滤过。取续滤液0.1mL，置10mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加4%氢氧化钠溶液4mL，再加50%乙醇溶液定容，摇匀，放置10min。置于比色皿中，以空白试剂作为参比，在波长500nm处测定吸光度。

表9 超声提取正交实验结果与分析

2.2.6 总黄酮含量测定的方法学考察

标准曲线的制备。取“2.2.1”项下芦丁对照储备液0.05mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.25mL、2.5mL，分别置于10mL容量瓶中，各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加4%氢氧化钠溶液4.0mL，再加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置10min。以空白试剂作为参比，在500nm波长处测定吸光度。以吸光度Y为纵坐标、浓度X为横坐标绘制标准曲线，得其回归方程为Y＝9.7028X－0.0169（r＝0.9999），其线性范围为2.165～108.25μg·mL－1。

稳定性实验。精密称取样品约1g，按上述最佳提取工艺制备供试品溶液，依法显色后测定吸光度，共测定2.5h，每0.5h一次，吸光度RSD＝3.00%（n＝6）。

精密度实验。精密称取样品约1g，按上述最佳提取工艺制备供试品溶液，依法显色后测定吸光度，共测定6次，吸光度RSD＝0.75%（n＝6）。

重复性实验。精密称取同一产地土茯苓粉末6份，每份1g，按上述最佳提取工艺制备供试品溶液，依法显色后测定吸光度并计算含量，其含量的RSD＝3.66%（n＝6）。

2.2.7 样品测定

分别精密称取不同产地的土茯苓粉末（过四号筛）约1g，按上述最佳提取工艺制备供试品溶液，并依法显色后在500nm波长处测定吸光度，代入标准曲线方程计算不同产地药材的总黄酮含量，结果如表10。

表10 不同产地土茯苓中总黄酮的含量

3 讨论

在总黄酮的显色条件中选用80%乙醇溶液较佳，但与50%乙醇溶液的显色效果接近。50%乙醇溶液对总黄酮的提取效果较理想，因此选用50%乙醇溶液作为提取溶剂。不同产土茯苓中落新妇苷与总黄酮的含量都有比较大的差异，其中广东产的土茯苓中落新妇苷与总黄酮的含量均较高。本文利用正交试验法对土茯苓中黄酮类物质的提取工艺进行优化，为科学评价该药材质量提供了依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：17.

［2］张白嘉，刘亚欧，刘榴，等.土茯苓及落新妇苷抗炎、镇痛、利尿作用研究［J］.中药药理与临床，2004，20（1）：11－12.

［3］XU Q，WU FH，CAO JS，et al.Astilbin selectively induces dys－function of liver－infiltrating cells－novel protection from liverdamage［J］.Eur J Pharmacol，1999，377（1）：93－100.