创造酶切位点与PCR-RFLP原理在基因多态检测中的应用探讨

2011-07-20孙东杰岳馨培孙成林

河南医学研究 2011年3期

孙东杰，岳馨培，师乐，孙成林，王威

(郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室河南郑州 450001)

单核苷酸多态性(SNP)指染色体基因组水平上单个核苷酸变异。SNP检测中，聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)技术具有操作简单、特异性高、重复性好等优点，特别适用于已知突变位点检测［1］。对无合适内切酶或内切酶价格昂贵时，可引入错配碱基创造酶切位点(Create restriction site，CRS)方法设计引物，然后进行PCR-RFLP检测［2］。

该文总结了应用CRS方法结合PCR－RFLP原理对多个SNP检测方法的研究结果［3－6］，探讨了该方法在基因多态检测中的注意事项，为相关研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器试剂:2×PCR mix(MBI公司)，限制性内切酶MSPI(MBI公司)，琼脂糖(BBI公司)，引物由上海 Sangon公司合成。仪器:9600型PCR仪(PE公司)，微型电泳槽(Pharmacia Biotech，EPS1000)，Gel Doc 2000凝胶成像仪(Bio－RAD公司)。PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法 CRS－PCR－RFLP是根据引物碱基错配技术设计的检测单碱基突变的方法。其原理是根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计引物，其中一条引物根据突变位点邻近序列设计，引入错配碱基，使得引物3’端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点，然后应用相应内切酶酶切鉴定。

1.3 序列查找及引物设计在NCBI网站查找基因序列和SNP信息，结合文献确定多态碱基信息，利用Primer Premier5.0软件分析内切酶识别情况，设计引入错配碱基的引物并确定创造的酶切位点。

1.4 PCR扩增及酶切鉴定取50 ng的基因组DNA、每个引物 0.2 μmol/L、1 × PCRmix、ddH2O 组成25 μl反应体系。PCR反应条件为首先94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，根据引物Tm值取(55～60)℃退火20 s，72℃延伸20 s，共30个循环后72℃延伸10 min。PCR后，取PCR产物10 μl，加入5 u内切酶和2 μl 10×酶切缓冲液和ddH2O组成20 μl反应体系，37℃水浴2～16 h后，电泳后凝胶成像观察。

2 结果

2.1 序列搜索与多态位点确定查找NCBI的SNP数据库，收集 MGMT、ADH2、MTHFR和 PON2基因全序列及相关多态位点。各基因多态位点情况见表1。

2.2 序列分析与引物设计经序列分析可知可识别原多态序列的内切酶及其价格情况，对价格较贵者进行错配分析。通过碱基错配将多态位点附近碱基进行替换，直至形成可被较廉价内切酶识别的序列。然后根据错配位点情况确定上下游引物的位置与长度(设计引物、选择的内切酶及其识别碱基情况见表1)。其中MGMT基因多态rs2308321和rs2308327因位点接近而设计一对特殊引物，两引物分别进行碱基错配，PCR后分别采用不同内切酶进行多态鉴定。

2.3 实验验证通过PCR-RFLP实验验证，结果与预期一致。不同基因型PCR产物测序结果亦符合预期。