桂皮醛诱导K562细胞分化增强Mel18表达

刘黎琼 刘 泽林 王 欣 王 淡瑜 崔 海燕 金梦迪

恶性肿瘤的诱导分化治疗已成为目前肿瘤生物学和肿瘤治疗学的前沿领域和研究热点，尤其是中药提取物的诱导分化研究是热点中的热点。桂皮醛是食用香料肉桂提取物的主要活性成分，具有安全无毒特点。桂皮醛可对多种恶性肿瘤调亡发挥抑制增殖、诱导凋亡的效应，我们的前期研究也显示桂皮醛可诱导慢性粒细胞性白血病细胞株K562凋亡，但尚无桂皮醛诱导分化效应研究的报道［1－3］。本实验观察桂皮醛诱导K562细胞分化改变及探讨相关机制，以进一步研究桂皮醛抗肿瘤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象与主要试剂 人慢性髓细胞白血病细胞株K562来自华中科技大学同济医学院协和医院干细胞研究与应用中心保存。桂皮醛(分子式C9H8O，分子量132.16，纯度大于95%，购自上海国药集团化学试剂有限公司)，用二甲基亚砜配成贮存液。藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)标记的抗人CD11b单克隆抗体(CD11b-PE)、异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate，FITC)标记的抗人CD14抗体(CD14-FITC)购自美国 BD(Becton，Dickinson and Company)公司。兔抗人Mel18多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG多克隆抗体(IgG-FITC)购自Santa Cruz公司。兔抗人c-Myc多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自Cell signaling公司。

1.2 细胞培养与分组 K562细胞用RMPI 1640完全培养液在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每2～3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验(要求细胞活性＞98%)。实验组加入桂皮醛使终浓度分别为30 μmol/L和60 μmol/L，对照组加入等体积含二甲基亚砜的RPMI 1640(二甲基亚砜浓度与实验组相同，均 ＜0.1%)，继续培养24 h。

1.3 流式细胞术

1.3.1 细胞分化检测:收集各组细胞，充分洗涤后，加入CD11b-PE和CD14-FITC标记，PBS洗后重悬，上流式细胞仪检测。数据经CellQuest软件进行分析。

1.3.2 Mel18表达检测:收集各组细胞，固定，破膜，加入兔抗人Mel18单抗(一抗)，孵育，洗涤后加入羊抗兔 IgG-FITC标记(二抗)，上流式细胞仪检测。数据经CellQuest软件进行分析。

1.4 Western blot检测 收集各组细胞，提取细胞总蛋白，凝胶分离、转膜、免疫杂交。一抗为兔抗人c-Myc抗体或兔抗GAPDH抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。充分漂洗后在化学放光试剂中反应，暗房曝光后冲洗胶片、扫描，输入计算机。

1.5 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桂皮醛对K562细胞表面分化抗原的影响 经30 μmol/L和60 μmol/L桂皮醛处理24 h后，K562细胞表面单核细胞分化抗原CD11b和CD14表达率增加，并呈浓度依赖性改变，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。这提示桂皮醛诱导K562细胞向单核细胞方向分化。

表1 桂皮醛诱导K562细胞分化抗原表达n=3，%，±s

表1 桂皮醛诱导K562细胞分化抗原表达n=3，%，±s

注:与对照组比较，*P ＜0.01

组别 CD11b阳性率 CD14 2.9 ±0.6 2.3 ±1.3实验组30 μmol/L 10.9 ±1.3* 8.7 ±1.3*实验组60 μmol/L 75.7 ±2.3* 84.1 ±3.5阳性率对照组*

2.2 桂皮醛增强Mel18表达 K562细胞自身表达 Mel18，60 μmol/L桂皮醛处理24 h后，k562细胞Mel18平均荧光强度与对照相比明显增加;见图1。这提示桂皮醛诱导K562细胞分化伴Mel18表达增加。

2.3 桂皮醛降低c-Myc表达 经Western blot检测结果表明，c-Myc在K562细胞阳性表达，经60μmol/L桂皮醛处理24 h诱导细胞分化后，c-Myc表达明显下降。见图2。

图1 桂皮醛增强K562细胞Mel18表达

图2 桂皮醛降低c-Myc表达

3 讨论

白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病，白血病细胞增殖失控、凋亡和分化受阻，诱导白血病细胞凋亡和分化是目前白血病化学治疗的主要方法。有报道证实，许多通过细胞毒方式杀伤白血病的药物在低浓度时可诱导白血病细胞分化;多种传统中药的活性成分对白血病细胞同时有诱导凋亡和分化效应［4］。桂皮醛是食用香料肉桂提取物的主要活性成分，在癌症防治方面具有重要作用，我们的前期工作发现较高浓度桂皮醛可诱导K562凋亡［3］。在本研究中，我们发现低浓度桂皮醛可诱导人白血病细胞K562分化，并表现为浓度依赖性。

癌基因激活和抑癌基因失活是各种肿瘤发生和演进的基础，增强抑癌基因的表达和功能可抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞分化和凋亡［5］。mel18为PcG基因家族成员，表达于正常乳腺组细胞和较成熟造血细胞［6，7］。研究发现，分化抑制因子1(inhibitor of differentiation Id1)可通过下调mel18表达进而上调原癌基因c-myc，有助于肿瘤发生［8］。增强mel18表达可抑制乳腺癌细胞株克隆形成和原癌基因c-Myc表达，我们既往研究显示转染外源性 mel18可抑制人白血病细胞U937生长［9，10］。以上结果显示，mel18为一潜在抑癌基因。近来研究发现mel18在原代急性髓细胞白血病细胞也有广泛表达［11］。因此，mel18在白血病中具体发挥何种作用尚不明确，值得进一步深入探讨。本研究发现，人白血病细胞K562表达Mel18及c-Myc，桂皮醛诱导K562细胞分化同时增强Mel18表达和削弱c-Myc表达。这说明mel18虽然在白血病细胞中也有表达，但mel18表达增强仍有助于白血病细胞向成熟方向分化，发挥抑癌基因功能，Mel18表达增加可能是桂皮醛诱导K562细胞分化的重要机制之一，其具体调控机制有待进一步研究。

总之，桂皮醛可诱导白血病细胞分化，PcG基因家族成员mel18参与这一过程，发挥抗白血病效应。这为桂皮醛对白血病的作用及其机制研究提供了新的理论参考依据，并为mel18在白血病中作用的研究提供了前期实验基础。

1 Ka H，Park HJ，Jung HJ，et al.Cinnamaldehyde Induces apoptosis by ROS-mediated mitochondrial permeability transition in human promyelocytic leukemia HL-60 cells.Cancer Lett，2003，196:143-152.

2 Lee CW，Lee SH，Lee JW，et al.2-Hydroxycinnamaldehyde inhibits SW620 colon cancer cell growth through AP-1 inactivation.J Pharmacol Sci，2007，104:19-28.

3 Zhang JH，Liu LQ，He YL，et al.Cytotoxic effect of trans-cinnamaldehyde on human leukemia K562 cells.Acta Pharmacol Sin，2010，31:861-866.

4 Jiang G，Albihn A，Tang T，et al.Role of Myc in differentiation and apoptosis in HL60 cells after exposure to arsenic trioxide or all-trans retinoic acid.Leuk Res，2008，32:297-307.

5 Chylicki K，Ehinger M，Svedberg H，et al.Characterization of the molecular mechanisms for p53-mediated differentiation.Cell Growth Differ，2000，11:561-571.

6 Kajiume T，Ohno N，Sera Y，et al.Reciprocal expression of Bmi1 and Mel-18 is associated with functioning of primitive hematopoietic cells.Exp Hematol，2009，37:857-866.e2.

7 Lessard J，Baban S，Sauvageau G.Stage-specific expression of polycomb group genes in human bone marrow cells.Blood，1998，91:1216-1224.

8 Qian T，Lee JY，Park JH，et al.Id1 enhances RING1b E3 ubiquitin ligase activity through the Mel-18/Bmi-1 polycomb group complex.Oncogene，2010，29:5818-5827.

9 刘黎琼，李玥莹，刘伟，等.增强MEL18表达抑制白血病细胞U937生长.华中科技大学学报(医学版)，2008，37:125-128.

10 Guo WJ，Zeng MS，Yadav A，et al.Mel-18 acts as a tumor suppressor by repressing Bmi-1 expression and down-regulating Akt activity in breast cancer cells.Cancer Res，2007，67:5083-5089.

11 Grubach L，Juhl-Christensen C，Rethmeier A，et al.Gene expression profiling of Polycomb，Hox and Meis genes in patients with acute myeloid leukaemia.Eur J Haematol，2008，81:112-122.