消旋丁苯肽对血管性痴呆大鼠认知功能的影响*

王义义 许 静 杨 卓

血管性痴呆（VD）是脑血流减少引起的脑组织损伤所导致的进行性记忆以及认知功能的损伤。在英美国家中，其发病率仅次于阿尔茨海默病（AD）[1]。VD表现为进行性的认知功能下降，影响患者的生活质量，同时也给监护人带来困难。消旋丁苯肽（dl-NBP）是从天竺葵属植物芹菜籽中提取的成分，dl-NBP包括左旋丁苯肽和右旋丁苯肽，主要用于中风的治疗。在治疗卒中的研究中发现dl-NBP可改善微循环[2]并减少神经元的凋亡[3]。以上作用机制也是参与VD疾病中神经元损伤的机制[4]。本研究旨在评价dl-NBP对VD的认知障碍是否有改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠 成年雄性健康清洁级Wistar大鼠30只，体质量200～250 g，购于军事医学科学院实验动物中心。随机分为对照组、VD组和VD给予dl-NBP干预（VD+dl-NBP）组，每组10只。

1.2 动物模型制造 实验采用双侧颈总动脉永久性结扎（2VO）结合高脂喂养的方法造模。首先对VD组和VD+dl-NBP组大鼠进行高脂饲料（购自天津市利居生物用品有限公司）喂养3周，然后进行双侧颈总动脉永久性结扎手术。使用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，颈部皮肤备皮，碘伏消毒后沿中线切开约1.5 cm的切口，找到并游离双侧颈总动脉，结扎。70%乙醇消毒后缝合伤口，将大鼠放回笼中饲养，自由摄食水。对照组大鼠仅手术切开颈部皮肤和皮下组织后便缝合，放回笼中饲养。VD+dl-NBP组大鼠手术后当天开始给予dl-NBP（40 mg/kg）灌胃，1次/d，共30 d。

1.3 Morris水迷宫（MWM）实验 造模后第30天进行MWM实验，用于评价大鼠空间学习和记忆的能力。实验设备包括一个圆形的水池，充满水（约60 cm深）并用墨汁将水染黑。水池以假想的十字线分为4个象限，分别以1、2、3、4代表。将一个直径10 cm的平台置于水面下1.5 cm。MWM实验分为2部分：定位航行实验和空间搜索实验。定位航行实验历时5 d，每天分上、下午两段，上下午各训练4次，从4个象限分别放大鼠入水。平台放在第二象限。共训练8次。记录大鼠爬上平台所需时间（逃避潜伏期，escape latency）。如果大鼠在60 s内未找到平台，则将其引至平台，并保持5 s，潜伏期记为60 s。整个实验过程中，水池周围参照物位置不变。空间搜索实验用于观察大鼠对平台空间位置记忆的能力。即在实验的第6天撤除平台，将大鼠放入水中，测其在60 s内在原平台象限搜索时间占总游泳时间（60 s）的百分比。

1.4 记录海马区CA3-CA1长时程增强（LTP） 在MWM结束后当天，大鼠经30%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉后，进行LTP记录。首先将头固定于头颅立体定位仪（Narishinge，Japan）。在大鼠头顶部切开大约1.5 cm切口，暴露颅骨。定位刺激电极和记录电极的位置，刺激电极位置在前囟后4.2 mm,中线旁3.5 mm；记录电极在前囟后3.5 mm，中线旁2.5 mm。在电极位于颅骨的投影处将颅骨打开，掀去硬脑膜，将刺激电极和记录电极轻轻插入左侧海马，电极深度根据生理学标准确定[5]。在scope软件中记录场兴奋性突触后电位（fEPSP）。20 min基础的fEPSP记录后，给予高频刺激（HFS，10 Hz的串刺激，脉冲组数为10，主周期为2 s，重复次数为10）。然后再记录60 min。以基础fEPSP后5 min的斜率为基值，以HFS诱导后50～60 min的fEPSP的斜率除以基值来表示LTP的幅值。

1.5 统计学处理 统计学分析采用SPSS 16.0软件。数据以均数±标准差±s）表示。MWM中定位航行阶段组间比较采用重复测量方差分析，其他数据3组比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

2.1.1 定位航行实验结果比较 在前5 d的定位航行阶段，3组大鼠的逃避潜伏期组间比较差异有统计学意义（均P<0.01），不存在交互效应（P>0.05）。VD组低于对照组和VD+dl-NBP组，差异均有统计学意义（均P<0.01），见表1。

表1 3组大鼠逃避潜伏期比较 （n=6，s±s）

表1 3组大鼠逃避潜伏期比较 （n=6，s±s）

F组内 =39.549，F组间=11.361，均P<0.01；F交互 =0.133，P>0.05

组别对照组（1）VD组（2）VD+dl-NBP组（3）第1天26.25±4.16 36.59±6.88 27.40±1.66第2天11.69±2.09 23.14±5.79 11.35±1.82第3天7.52±0.94 18.53±4.32 8.54±1.07 5.29±0.75 15.18±4.42 6.50±1.33组比（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）P 0.001 0.672 0.001统计学处理5.84±0.89 15.04±2.73 7.99±1.17对照组（1）VD组（2）VD+dl-NBP组（3）组别 第4天 第5天

2.1.2 空间搜索实验 在第6天的测试阶段，对照组、VD组及VD+dl-NBP组的目标象限百分比分别为（51.1±2.87）%，（37.03±3.50）%，（54.42±3.06）%。差异有统计学意义（F=12.03，P<0.01）。VD组低于对照组（P=0.02）和VD+dl-NBP组（P<0.001），见图1。

2.2 3组长时程增强结果比较 由HFS诱发的长时程增强，箭头所指为给予HFS的时点，见图2a。对照组、VD组和VD+dl-NBP组的LTP幅值分别为（133.4±10.1）%、（108.4±16.9）%和（120.5±7.3）%，差异有统计学意义（F=94.21，P<0.01）。VD组低于对照组和VD+dl-NBP组，差异均有统计学意义（均P<0.001），见图2b。

3 讨论

血管性痴呆是最常见的痴呆之一，缺血性血管疾病是引起VD的主要原因。VD的动物模型最为常用的造模方法是血管闭塞方法，其中双侧颈总动脉结扎的方法操作简单，有利于慢性病程的观察[6]。在双侧颈总动脉结扎的基础上给予高脂饲养，是一种改良的VD动物模型，VD大鼠表现出的智能障碍和行为学改变更加明显[7]。因此本研究使用双侧颈总动脉结扎结合高脂喂养的方法建立血管性痴呆模型。LTP是指突触连接前后两个神经元之间信号传递的长时间的增强。是学习记忆的分子模型[8]。MWM是一种广泛用于测定大鼠空间学习记忆的行为学实验[9]。MWM和LTP的实验结果表明VD组大鼠与对照组大鼠比较，逃避潜伏期明显延长，目标象限百分比以及LTP均明显下降，大鼠表现出明显的学习记忆能力的下降，提示造模成功。

目前用于治疗VD的药物有很多类，如胆碱酯酶抑制剂、脑细胞代谢赋活剂、钙拮抗剂、麦角生物碱制剂、神经营养因子、血管扩张剂等[10]。但是还没有满意的预防以及治疗VD的药物。丁苯酞又名芹菜甲素，是从芹菜籽中分离出的有效成分，其有效机制涉及脑缺血病理的多个环节,对缺血性卒中具有较强的治疗作用。在MWM定位航行阶段以及空间搜索阶段的研究中，VD+dl-NBP组大鼠的逃避潜伏期以及目标象限百分比，与VD组大鼠比较都有非常明显的改善，提示dl-NBP具有改善VD大鼠学习和记忆的作用。在电生理实验中，数据显示VD+dl-NBP组大鼠的LTP较VD大鼠明显提高，海马LTP是学习记忆的分子基础。因此提示dl-NBP具有改善VD大鼠的LTP，对于大鼠的空间学习和记忆能力起到提高的作用。

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