鲑鱼降钙素对乳腺癌骨转移大鼠机械痛敏的影响

王明霞，孙长岗，唐世锋

(1.潍坊医学院，山东潍坊261042;2.潍坊市中医院肿瘤科，山东潍坊261041)

乳腺癌是成年女性多发的恶性肿瘤，有很高的发病率和死亡率，骨骼是乳腺癌转移最常见的部位，且癌性骨转移对患者的生活质量和身体机能影响较大［1］。因此针对癌性骨痛治疗的研究受到广泛关注。蛙鱼降钙素的主要作用是抑制破骨细胞的活性，防止骨钙丢失，减少骨吸收而增加骨质量，其生物活性比人类降钙素高20～40倍，其也具有一定的抗炎和中枢止痛作用。本实验主要研究其对癌性骨转移所致疼痛的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 雌性Wistar大鼠60只，体质量180～200 g，购自山东大学实验动物中心;鲑鱼降钙素，购自庆安医药公司;von－Frey全套毛针BME－403，由中国医学科学院生物工程研究所提供;Walker 256细胞，购自北京百和科技发展有限责任公司;唑来膦酸，购自美国LKT公司。

1.2 乳腺癌骨转移模型的制备

1.2.1 细胞体外无菌环境培养方法 取出Walker 256细胞冻存管，迅速放入37℃水浴箱中快速解冻。擦干冻存管上的水渍，用体积分数75%酒精消毒管口，超净工作台上旋开管口，用吸管吸出细胞悬液，移入离心管中，再补加适量含质量分数10%胎牛血清的RPMI－1640培养基，吹打使细胞悬浮，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复用培养基漂洗1次，加入适量培养基后接种于培养瓶中，置于培养箱中培养，次日更换1次培养基继续培养，观察生长情况，选取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞 Wistar大鼠体内环境培养方法 选择Wistar大鼠乳腺癌肉瘤细胞株Walker 256细胞，于同系Wistar大鼠腹腔内接种Walker 256细胞0.5 mL(2×107mL－1)，饲养1周，大鼠腹腔内有大量腹水，取微黄色瘤性腹水3 mL，加质量分数0.9%生理盐水7 mL混匀，1 500 r/min离心5 min，取沉淀，用质量分数0.9%生理盐水10 mL漂洗后，1 200 r/min再次离心5 min，弃上清，细胞沉淀用3 mL质量分数0.9%生理盐水悬浮，细胞计数后将细胞悬液稀释到2×107mL－1备用。

1.2.3 大鼠乳腺癌骨转移癌痛模型建立 参照姚明等［2］的方法建立大鼠胫骨癌痛模型:质量分数4%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后，以大鼠脚趾对有齿镊钳夹无反应为麻醉满意指标，消毒并切开左侧胫骨下1/3皮肤，分离肌肉，暴露胫骨骨面。取5号钢针头垂直于骨面进针，待有骨突破感后拔出针头，用注射器取细胞悬液5 μL注入骨髓腔内，用无菌骨蜡封孔，逐层用质量分数0.9%生理盐水冲洗并缝合。接种肿瘤细胞手术后将动物放置于笼中继续饲养。假手术动物(即空白组)注入等量的质量分数0.9%生理盐水。

1.3 实验分组及给药 接种肿瘤细胞手术后第8天始给药。鲑鱼降钙素组:骨癌痛模型制备成功后，隔日皮下注射鲑鱼降钙素7.5 ng/d;鲑鱼降钙素+唑来膦酸组:骨癌痛模型制备成功后，隔日皮下注射鲑鱼降钙素 7.5 ng/d+ 缓慢皮下注射唑来膦酸 0.1 mg/kg，2次/周;唑来膦酸组:骨癌痛模型制备成功后，隔日缓慢皮下注射唑来膦酸0.1 mg/kg，2次/周，其余时间给予质量分数0.9%生理盐水;对照组:骨癌痛模型制备成功后，隔日皮下注射质量分数0.9%生理盐水;空白组:隔日皮下注射质量分数0.9%生理盐水。

1.4 机械痛敏的测定 接种肿瘤细胞手术后的第8、13、18、23、28 天，用电子 von Frey测痛仪刺激大鼠足底柔软部位，接触时间2～3 s，出现缩足或舔足反应时的读数为机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，阈值上下各刺激3次，间隔5 min。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0进行统计分析，计量资料以±s表示，比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

与空白组相比，大鼠于骨癌痛模型制备后的第8天MWT明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与对照组相比，各治疗组大鼠于骨癌痛模型制备后的第18、23天MWT提高，其中鲑鱼降钙素+唑来膦酸组MWT升高明显，差异有统计学意义(P＜0.05);鲑鱼降钙素组、唑来膦酸组仅表现出MWT升高趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。于骨癌痛模型制备后的第28天，各治疗组MWT较对照组提高，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示鲑鱼降钙素、唑来膦酸对癌性骨痛大鼠均具有提高MWT，降低机械痛敏的作用。见表1。

表1 术后不同时点大鼠MWT的比较

3 讨论

肿瘤转移至骨骼系统将诱发产生持续性骨癌痛，且随着时间推移日益加剧，可造成患者的身体机能和生活质量严重下降。有研究表明，高达80%的乳腺癌患者会在不同阶段出现骨转移病灶，而由乳腺癌骨转移所引起的骨相关事件(高钙血症、病理性骨折、骨痛、神经压迫症状等)是导致晚期患者生活质量严重下降及致死的重要原因之一［3－5］。目前乳腺癌骨转移的治疗方法主要有放疗、化疗、内分泌治疗和靶向治疗，但这些方案都有一定的局限性。因此，发现新的药物治疗骨癌痛至关重要。而1999年Schwei等［6］首次报道了小鼠骨癌痛的模型，推动了癌痛的基础研究，为抗癌痛药物的研制及发现提供了一个很好的平台。

本实验在骨癌痛模型制备成功后，分别给予鲑鱼降钙素、唑来膦酸或两药联合，通过测定MWT观察鲑鱼降钙素用于乳腺癌骨转移性癌痛的可行性及效果，结果表明鲑鱼降钙素和唑来膦酸联合应用效果最佳。

综上所述，鲑鱼降钙素能减轻骨癌痛，鲑鱼降钙素和唑来膦酸联合使用效果更加明显。这为临床用药提供了理论依据，也为骨癌痛的治疗提供了新思路。

［1］Ghilardi JR，Röhrich H，Lindsay TH，et al.Selective blockade of the capsaicin receptor TRPV1 attenuates bone cancer pain［J］.J Neurosci，2005，25(12):3126 －3131.

［2］姚明，杨建平，王丽娜，等.腹水传代与体外培养Walker 256癌细胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性［J］.中华医学杂志，2008，88(13):880－884.

［3］Martin TJ，Moseley JM.Mechanisms in the skeletal complications of breast cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2000，7(4):271 －284.

［4］Weiss L.Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy［J］.Clin Exp Metastasis，1992，10(3):191－199.

［5］Yoneda T，Williams PJ，Hiraga T，et al.A bone－seeking clone exhibits different biological properties from the MDA－MB－231 parental human breast cancer cells and a brain－seeking clone in vivo and in vitro［J］.J Bone Miner Res，2001，16(8):1486 －1495.

［6］Schwei MJ，Honore P，Rogers SD，et al.Neurochemical and cellular reorganization of the spinal cord in a murine model of bone cancer pain［J］.J Neurosci，1999，19(24):10886 －10897.