组蛋白去乙酰化酶2在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义

陈 琛

(郑州大学第二附属医院病理科，河南郑州450014)

目前，宫颈癌的发病率居高不下，且预后极差，因此寻找转移相关基因来诊断宫颈癌显得意义重大。近年来的研究显示，组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2，HDAC2)作为该家族重要的Ⅱ型成员在肿瘤的发生、发展中发挥着极其重要的作用［1－3］。抑制HDAC的活性或表达已经成为恶性肿瘤治疗的十分有用的分子靶点［4－7］。本研究采用免疫组化和原位杂交(in situ hybridization，ISH)方法联合检测HDAC2在宫颈鳞癌组织及正常宫颈黏膜组织中的表达情况，并分析其表达与宫颈鳞癌的临床病理学特征的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 80例宫颈鳞癌及25例正常宫颈黏膜组织，均来自于2006年5月至2011年8月郑州大学第二附属医院妇产科手术切除标本。所有宫颈鳞癌患者术前均未服用任何抗肿瘤药物，均未接受放、化疗。80例宫颈鳞癌患者年龄为25～74岁，平均年龄(53.1±12.3)岁，其中年龄 ＜50岁者27例，≥50岁者53例。依据WHO 1985年肿瘤细胞分化程度规定，其中高分化癌11例，中分化癌45例，低分化癌24例。依据国际妇产科联盟(FIGO，2000)修订的TNM分期标准，其中Ⅰ期37例，Ⅱ期43例。依据淋巴结转移情况分类，其中有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者49例。标本经40 g/L多聚甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚度4～6 μm，用于 HE、免疫组织化学及原位杂交染色。

1.2 主要试剂及探针合成 预杂交液、SA－Bio－AP、BCIP/NBT均购自武汉博士德生物技术有限公司。探针序列:原位杂交5’端生物素标记、全硫代修饰探针由北京奥科生物技术有限公司合成。HDAC2探针序列:5’－CTAGTCTAAAAGTGGATGA－3’。HDAC2 单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组织化学试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化方法 采用免疫组化S－P法，常规脱蜡，PBS清洗，抗原修复，体积分数3%H2O2清除内源性过氧化物酶活性，PBS清洗，滴加正常山羊血清封闭，加Ⅰ抗(即用型)，4℃冰箱过夜，PBS清洗，加Ⅱ抗，PBS清洗，加Ⅲ抗，PBS清洗，DAB显色。苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用Novus Biologicals公司提供的切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 ISH方法 标本经新鲜配制二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后，用新鲜配制的体积分数0.5%H2O2室温处理30 min，以灭活内源性过氧化物酶;质量分数3%柠檬酸新鲜配制蛋白酶(0.01 g/L)，37 ℃，10 min，消化标本DNA结合蛋白;每张玻片滴加20 μL不含探针的预杂交液(42℃)，预杂交4 h;加含探针(1 ng/L)的杂交液，42℃湿盒内杂交12 h;柠檬酸盐42℃洗后，加 SA－Bio－AP 37 ℃，10 min;漂洗后加BCIP/NBT，避光显色2～4 h。以不含探针的标本作阴性对照。

1.5 结果判定 HDAC2蛋白及mRNA阳性信号分别呈黄色及紫蓝色颗粒样物质，分别位于细胞核及细胞质内。高倍镜下随机选取5个视野(每个视野观察细胞数不少于200个)，按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定［8］。采用9分评分制。按照阳性细胞所占百分比:阳性细胞＜10%为1分，10% ～50%为2分，＞50%为3分;按染色程度强弱:阴性为0分，淡黄(蓝)色染色为1分，中度黄(蓝)色染色为2分，棕黄(紫蓝)色染色为3分。然后将两项评分的乘积作为总分，总分＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.6 统计学处理 应用SPSS 11.0进行统计分析，率的比较用χ2检验，相关性检验用Spearman相关分析，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 HDAC2蛋白表达情况 HDAC2蛋白阳性信号定位于细胞核中，呈淡黄至棕黄色颗粒样物质(图1)。HDAC2蛋白在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率(65.0%)显著高于正常宫颈黏膜组织(16.0%)(χ2=18.375，P ＜0.001)。不同临床病理学特征的宫颈鳞癌组织中HDAC2蛋白的表达情况见表1。

图1 宫颈鳞癌组织中HDAC2蛋白的表达(S－P×400)

2.2 HDAC2 mRNA表达情况 HDAC2 mRNA阳性信号定位于细胞质中，呈蓝紫色颗粒样物质(图2)。HDAC2 mRNA在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率(57.5%)显著高于正常宫颈黏膜组织(8.0%)(χ2=18.807，P ＜0.001)。不同临床病理学特征的宫颈鳞癌组织中HDAC2 mRNA的表达情况见表1。

图2 宫颈鳞癌组织中HDAC2 mRNA的表达(ISH×400)

表1 HDAC2蛋白及mRNA表达与宫颈鳞癌临床病理学特征的关系

2.3 HDAC2蛋白及mRNA在宫颈鳞癌组织中表达的相关性 HDAC2蛋白及mRNA在宫颈鳞癌组织中的表达呈正相关关系(r=0.482，P ＜0.05)。见表2。

表2 HDAC2蛋白及mRNA表达的相关性分析

3 讨论

HDACs是由一组酶组成的，其主要的功能是从ε－N－乙酰赖氨酸中删除乙酰基团。因为真核生物DNA的组织和包装主要通过核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的增加来完成，从而形成染色质这种复合物的结构，核心组蛋白的修饰对于染色质构象的改变是十分重要的［9－10］。乙酰化水平也影响转录的活性:乙酰化诱导开放的染色质构象，这种构象可提高转录效率。染色质的乙酰化与转录活性相关，而去乙酰化与基因沉默有关。HDACs也涉及到非组蛋白可逆的乙酰化。有研究显示，HDAC2在口腔肿瘤组织中均呈现过表达，其过表达与口腔肿瘤的晚期和预后差关系密切［11］。Chang等［12］检测了 5 株头颈部肿瘤细胞系Ca9－22、Cal－27、HSC－3、SAS 和 TW2.6 中 HDAC2 的表达，并构建HDAC2的过表达载体和shRNA载体分别研究其表达上调或下调对口腔肿瘤浸润和转移能力的影响，结果发现敲除SAS细胞中HDAC2的表达导致肿瘤发生和进展能力的下降。Fritzsche等［13］在肾癌细胞中发现了HDAC2的高表达，其表达的阳性率大约为60%，提示HDAC2作为原癌基因在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。

本研究结果显示，HDAC2在正常宫颈黏膜组织中蛋白及mRNA表达均较低，在宫颈鳞癌组织中的表达则显著升高;HDAC2蛋白及mRNA表达与宫颈鳞癌的TNM分期及淋巴结转移有关，这就提示HDAC2蛋白及mRNA的过表达是宫颈鳞癌癌变过程中的一个早期事件，可能与肿瘤的发生、发展、浸润、转移及演进过程有密切的关系。

本研究通过对HDAC2蛋白及mRNA表达情况的相关性分析发现，宫颈鳞癌组织中HDAC2蛋白的表达与HDAC2 mRNA的表达呈正相关，提示其蛋白表达与mRNA表达具有一致性。HDAC2蛋白及mRNA的联合检测有助于合理评估患者的病程，给临床治疗方案的合理制定提供有益的参考。

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