晚期氧化蛋白产物对肾小管上皮细胞表型转分化影响的基础研究

陈咏梅 邹世海 陈咏梅 彭 鑫 朱赛香

（深圳市宝安区人民医院血液透析室，广东 深圳 518101）

肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同病理过程，其严重程度跟很多慢性肾病的预后密切相关。肾小管上皮-间充质转化（EMT）是肾间质纤维化的主要机制之一[1-3]，大量肌成纤维细胞的生成和肌成纤维细胞标志性蛋白之一α-SMA的表达显著增加。晚期氧化蛋白产物（AOPP）是近年来引起重视的一类与炎症、氧化应激密切相关的氧化修饰蛋白。尿毒症时，肾小管上皮细胞经常面临多种毒素的损伤。多种尿毒毒素可激活肾小管上皮细胞。已有研究表明，除大量白蛋白外，多种修饰后蛋白，如：低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白、晚期糖基化终产物等，均可激活肾小管上皮细胞出现不同程度的表型转分化[4]。本研究通过免疫组化观察AOPP是否会影响α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）等标志物的水平，旨在研究AOPP是否可诱导肾小管上皮细胞活化，转分化，以及参与肾间质炎证、纤维化的过程机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

人血清白蛋白（HAS）购自上海新兴，次氯酸购自上海试剂一厂，α-SMA及E-cadherin抗体购自武汉博士德公司，山羊血清、二抗、DAB等试剂购自北京中山公司，FBS，DMEM购自Hyclone公司。

1.2 AOPP-BSA的制备

按文献报道[2]方法，将60mg/mLHAS（PBS稀释）与次氯酸溶液等体积混合，室温搅拌反应1h（25～30℃），制备出BSA与次氯酸摩尔比为1∶140的AOPP。制备的AOPP-HAS加入β-巯基乙醇终止反应。将反应产物轩于超滤管中1000g离心超滤30min，加入适量PBS冲洗，再次离心超滤。AOPP含量通过以氯氨T浓度为标准从酸性条件下340nm的光吸收取得。

1.3 肾小管上皮细胞的培养

HK-2细胞株为人近曲肾小管上皮细胞株，正常HK-2细胞使用DMEM+10%FBS培养基传代培养，于37℃、5%CO2孵箱中生长。经Cytokeratin18蛋白染色鉴定证实为肾小管上皮细胞后用于实验。细胞长至80%以上融合时用0.25%胰酶进行消化，将细胞浓度调整至1×106/mL均匀接种至6孔培养板继续培养。细胞长至约70%～80%时进行实验。加入AOPP分别培养12h、24h、48h，收集细胞用于实验。所有实验均重复3次。

1.4 免疫组织化学

采用免疫细胞化学二步法观察肾小管上皮细胞α-SMA及E-cadherin的表达。收集细胞爬片，PBS冲洗3次，每次5min，4度4%多聚甲醛溶液固定细胞10min，PBS洗5min，共3次，3%H2O2处理10min，采用柠檬酸盐微波修复法进行抗原修复，自然冷却至室温后PBS洗5min，共3次，滴加一抗（1∶100稀释），4℃过夜，次日PBS冲洗5min，共3次后，滴加羊抗兔IgG抗体-HRP，PBS冲洗5min，共3次后滴加DAB显色剂显色，苏木素复染细胞核。PBS代替一抗作阴性对照。结果判断：显微镜下观察细胞形态并计数随机视野1000个细胞中阳性细胞百分数。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 肾小管上皮细胞α-SMA免疫组化结果比较

肾小管上皮细胞α-SMA染色阳性结果表现为细胞浆棕黄色颗粒，在正常大鼠中只在血管壁看到α-SMA阳性表达，近曲小管上皮细胞胞浆内无表达，而在AOPP诱导后，肾小管上皮细胞中可见到α-SMA弱阳性表达，表现为胞浆内散在的小颗粒，呈染色较浅的淡黄色，多见于脂肪变性的肾小管上皮细胞；当AOPP诱导后，可见α-SMA在肾小管上皮细胞的阳性表达率及表达量均明显上升，表现为无脂肪变性的肾小管上皮细胞亦有表达，且α-SMA阳性细胞胞浆中可见大量棕黄色颗粒。统计学结果显示，AOPP诱导肾小管上皮细胞后，α-SMA的阳性表达率较对照组均有显著上升（表1）。

2.2 肾小管上皮细胞E-cadherin免疫组化结果比较

肾小管上皮细胞E-cadherin染色阳性结果表现为胞膜及胞浆染成棕黄色，在正常大鼠中可见E-cadherin呈强阳性表达，而在AOPP诱导后，肾小管上皮细胞中可见到E-cadherin弱阳性表达，表现为胞浆内散在的小颗粒，呈染色较浅的淡黄色；当AOPP诱导后，可见E-cadherin在肾小管上皮细胞的阳性表达率及表达量均显著下降（表2）。

表1 AOPP对HK-2细胞α-SMA表达的影响[（±s），n=3]

表1 AOPP对HK-2细胞α-SMA表达的影响[（±s），n=3]

注：与对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01

组别α-SMA阳性率对照11.6±3.5 12h23.7±5.8*24h39.3±4.5**48h53.4±6.2**

表2 AOPP对HK-2细胞E-cadherin表达的影响[（±s），n=3]

表2 AOPP对HK-2细胞E-cadherin表达的影响[（±s），n=3]

注：与对照组比较，* P＜0.05；** P＜0.01

组别E-cadherin阳性率对照42.6±4.9 12h28.2±4.2*24h23.4±3.7**48h18.6±1.7**

3 讨 论

“肾小管上皮细胞表型转化”这个概念于1994年首先提出并得到多名学者的研究结果证实[5]。EMT时发生的四个关键步骤依次为：上皮黏附特性消失、α平滑肌肌动蛋白表达、突破基底膜、细胞迁移并入侵间质。肾小管上皮细胞EMT的起始步骤为E-cadherin的丧失。作为一种细胞间黏附连接蛋白，E-cadherin的主要作用是介导同种细胞间的黏附反应及参与建立和维持正常细胞间的连接[6]。它的丧失会引起形成紧密连接的相邻细胞间的紧密连接消失，细胞极性消失，出现表型改变。本文的研究结果显示：随AOPP刺激时间的延长，HK-2细胞E-cadherin的表达逐渐减少而α平滑肌肌动蛋白的表达，这一过程参与转分化过程。因此AOPP是一种新的具有氧化应激活性的尿毒症毒素，慢性肾功能衰竭的治疗应着眼于如何有效降低患者血浆中的AOPP水平。

[1] Galichon P,Hertig A.Epithelial to mesenchymal transition as a biomarker in renal fibrosis: are we ready for the bedside?[J].Fibrogenesis Tissue Repair,2011,6(4):11.

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[5] Liu Y.Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis:pathologic significance, molecular mechanism,and therapeutic intervention[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(1):1-12.

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