酶联免疫吸附试验检测人血浆中纤维蛋白原含量

姜国亮

纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)为肝脏合成的一种重要的血浆糖蛋白，是由健康人血浆分离，经提纯冻干制成。可提高血中纤维蛋白原浓度，促进血液凝固进而止血，缺乏、消耗过多或纤维蛋白酶亢进易导致凝血障碍。临床多用于妊娠中毒、死胎、产后出血、胎盘早期剥离、大手术、严重大出血等所引起的纤维蛋白原缺乏导致的凝血障碍。血浆中纤维蛋白原检测方法按原理可分为热/盐沉淀法，可凝固蛋白法和免疫法［1］。纤维蛋白原释放纤维蛋白肽A(FPA)的能力可反映纤维蛋白原分子结构、生物学功能完整性。本研究采用竞争抑制ELISA法测定FPA浓度，为检测纤维蛋白原生物学活性唯一方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 (1)0.05 mol/L PH9.6碳酸盐缓冲液包被液(2)0.01 mol/L PH7.4 PBS-Tween 20稀释液(3)洗涤液，同稀释液(4)10%BSA封闭液(5)TMB工作液(6)FPA(SIGMA)(7)羊抗人FPA抗体(8)辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体(9)Superblock溶液。

1.2 方法

1.2.1 原理 其原理是标本与凝血酶作用释放出FPA抗原，加入过量的FPA抗体(一抗)，FPA与部分抗体结合。将抗原抗体复合物加入包被有FPA的酶标板，混合液中未被结合的第一抗体与酶标板上的FPA结合，再加入酶标记的第二抗体，最后加酶底物显色。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

1.2.2 实验步骤 参考任跃明［2］等的方法进行，略有改动。稀释至10μg/ml的FPA抗原包被96孔板，4℃过夜，包被体积100μL/孔。洗甩5次后，加10%200μL/孔 BSA 37℃封闭2 h。用10%的Superblock溶液将样品稀释10倍后，加入等体积的凝血酶混匀，37℃放置30 min。然后用10%Superblock溶液将复溶的 FPA 稀释为2.5 ng/ml，10 ng/ml，40 ng/ml，80 ng/ml，160 ng/ml。然后取稀释标准液、悬液、及 10%Superblock溶液各75μL，加入300μL用生理盐水稀释750倍的羊抗人FPA，37℃水浴1 h。加100μL/孔于酶标板，37℃孵育1 h。洗甩5次后，加酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体1∶5000)100μL/孔37℃孵育1 h。洗甩5次后，加底物TMB显色5 min(100μL/孔)。最后每孔加50μLH2SO4终止反应。492 nm酶标仪下读OD值。

1.3 结果判定 参考任跃明［2］等的方法进行，略有改动。将FPA含量、对INVA做双对数直线回归，求得回归方程，计算样品的FPA含量，r应大于等于0.9 9。

2 结果

2.1 第二抗体稀释倍数选择 生理盐水将第二抗体稀释至500倍、1000倍、1300倍，用竞争抑制性ELISA法测定，根据测得A值绘制曲线，结果显示稀释1000倍为适宜的第二抗体稀释倍数。

2.2 凝血酶稀释度选择 40 mmol/LCaCl2稀释凝血酶至2.5、5、10、20、40、80、100、150 IU/ml，ELISA 测定，根据测得 A值绘制曲线，结果表明10 IU/ml为最适宜凝血酶作用浓度。

2.3 反应温度、时间选择 选择FPA抗原-第一抗体混合液分别选择作用45 min、1.5 h，选择室温，20℃、37℃三种不同温度，ELISA棋盘法测定，同上绘制曲线，结果表明室温1.5 h为较理想的作用条件。

2.4 人血浆中纤维蛋白原含量回收率分析 样品稀释液将FPA 标准品稀释至 60 ng/ml，20 ng/ml，5 ng/ml，结果分别为64.3、19.6、5.5 ng/ml，回收率分别为 107.2% 、98% 、110% 。

3 讨论

人纤维蛋白原为我国新近研制的产品，纤维蛋白肽A(FPA)的释放直接反映凝血酶活性，对于血清中FP的监测具有十分重要的意义。通常血浆中FP含量很低，如何建立灵敏度高、特异性好的检测方法显得尤为重要。临床主要采用放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)及高效液相层析法［3］。

ELISA法设备要求低，无辐射污染，样品用量少，灵敏度高、特异性好，在临床上应该广泛。本组试验在探索最佳实验条件后，用建立起来的竞争抑制性ELISA法测定人血浆蛋白原中，纤维蛋白肽A的含量，回收率高，操作简单方便，值得推广应用。

［1］ 段樱，刘树业.纤维蛋白原及其检测进展.哈尔滨医药，2008，28(1):50-53．

［2］ 任跃明，侯继锋.竞争抑制ELISA法检测FPA.中国实验诊断学，2009，13(11):1605-1607．

［3］ 王德明，李晓红，余蓉.纤维蛋白肽的研究进展.中国输血杂志，2005，18(4):348-350．