HPLC柱切换法比较轻度烧伤感染与中度烧伤感染患者头孢吡肟的血药浓度

段晓霞 郑小林 张春玉

烧伤感染为常见的烧伤并发症。国外学者研究表明烧伤感染患者由于其血浆蛋白水平的下降等生理原因，使其对药物的处置程度也相应发生变化，具体表现在药物的肾小球滤过率增加［1］、药物的代谢增加等，从而导致药物的血药浓度下降。为保证抗感染的效果，国外学者提出增加抗菌药物的剂量或者缩短其给药间隔期。头孢吡肟为新一代的头孢菌素类抗菌素，抗菌活性高，对β-内酰胺酶尤其是染色体介导的Richmond-sykesⅠ型β-内酰胺酶稳定，对产Ⅰ型β-内酰胺酶的革兰阴性杆菌有很强的抗菌活性。本药对产Ⅰ型β-内酰胺酶的肠杆菌属、枸橼酸菌属、沙雷菌属的抗菌活性超过头孢他定等第三代头孢菌素;对铜绿假单胞菌的抗菌作用与头孢他定相似或略差;对金黄色葡萄球菌等革兰阳性菌的抗菌活性也比第三代头孢菌素有所增强［2］。由于烧伤患者的体液平衡变化程度与烧伤的轻重程度有关，故为合理化应用抗菌药物，研究不同烧伤程度的抗菌药物浓度很有必要。有关轻度烧伤感染与中度烧伤感染患者头孢吡肟的血药浓度的比较，国内未见报道，为优化烧伤感染患者的抗菌药物给药方案，本文采用HPLC柱切换法比较了轻度与中度烧伤感染患者头孢吡肟的血药浓度。

1 设备与试剂

1.1 设备 Waters高效液相色谱仪(美国密理博公司)、Waters2010系统工作站(美国密理博公司)、Waters 996光电二极管阵列检测器(美国密理博公司)、Waters510双泵(美国密理博公司)、700柱切换阀(美国Rheodyne);HL-1型恒流泵(上海医疗器械厂);Rios超纯水器(美国Millipore公司);分析柱Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm);预柱(50 mm ×5 mm)，内装 μBondapak C18填料37～50μm，湿法装柱;高速离心机:上海医科大学仪器厂。

1.2 试剂 头孢吡肟(对照品，广州Sigma公司)、头孢曲松(分析纯，广州Sigma公司)、乙腈(色谱纯，天津四友试剂公司)、枸橼酸钠(分析纯，广州 Sigma公司)、二氯甲烷(分析纯，广州Sigma公司)、三氟乙酸(分析纯，广州Sigma公司)、双蒸水(自制，电阻率18 mΩ)。

2 方法与结果

2.1 样品采集 样品来源于15例轻度烧伤感染和11例中度烧伤感染男性患者，患者年龄(31±5)岁、体重(61±9)kg、体温(38.6±0.5)℃，血清肌酐max＜104μmol/min。血清样品均于静脉滴注完患者2 g头孢吡肟后的1，2，4，8和12 h采集并放置于-30℃的冰箱保存。

2.2 样品处理 在2 ml的在血清样品中加入1 mg/min-1头孢曲松内标液50μl旋涡振荡3 min后加入1 ml乙腈，再经旋涡振荡3 min后，以12000转/min转速离心5 min，取上清液加2 ml二氯甲烷后立即旋涡荡5 min，再高速离心(12000转/min)5 min，取上层水层进样25μl。

2.3 色谱条件 分析流动相:乙腈-水(4.5∶9.5V/V)，加适量枸橼酸钠调pH至5.5;流速:1.0 ml/min;检测波长:305 nm，灵敏度0.01AUFs，柱温(30±0.1)℃;预处理流动相:pH值2.6的磷酸溶液，流速:2.0 ml/min。

在该色谱条件下，样品、内标分离良好，色谱图谱如图2、图3。

2.4 柱切换分离测量流程

2.4.1 生物样本预处理 柱切换系统分离预处理流程装置见图1中虚线。生物样本注入预柱后，在预柱中进行纯化和富集，再经预处理流动相冲洗预柱。

图1 柱切换系统分离测量流程装置图

2.4.2 生物样本测量 柱切换系统分离预处理流程装置见图1中实线。待血浆中大部分杂质冲洗后，高压阀切换，使预柱和分析柱连接为串联状态，分析流动相进入预柱将保留在预柱中的氟尿苷冲洗入分析柱进行分离测量。然后切换阀经再次切回使分析柱和预柱的连接中断，用预处理流动相充分平衡预柱后，即可进行下次进样。柱切换操作时间表见表1，血浆测量色谱见图2，3。

图2 空白血浆色谱图

图3 头孢吡肟血浆色谱图(A:头孢吡肟，B:内标)

表1 柱切换操作时间表

2.5 标准曲线的配制 将25 mg头孢吡肟对照品溶于双蒸水配制成2 mg/ml的原液，然后于容量瓶中稀释为2000，1000，500，200，100，50，20，2.5 和 1 μg/ml的储备液。随后，将空白血浆加至上述储备液中，配制为 200，100，50，20，10，5，2，1，0.5μg/ml的血浆标准曲线。将25 mg头孢曲松对照品溶于双蒸水配制成1 mg/ml内标溶液。

2.6 标准曲线线性关系 分别取标准曲线样品2 ml，按2.2项下处理，进样25μl，经采集数据、建立头孢吡肟光谱库、优化积分参数，按头孢吡肟的浓度为横坐标、头孢吡肟与头孢曲松的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线。在血浆中头孢吡肟在0.5～200μg/ml的线性范围内得到线性关系良好的曲线方程:y=0.0347X+0.0059(r=0.9995)。

2.7 精密度试验及相对回收率试验 用空血浆配制头孢吡肟0.5，10，200 μg/ml三个浓度的血样，按“2.2”项下处理，进样，经2010系统工作站，按内标峰面积标准曲线法自动求得样品含量，计算相对回收率，结果头孢吡肟浓度为0.5μg/ml的平均回收率(92.91±6.71)%，RSD:7.22%;10μg/ml的平均回收率(95.13±4.85)%，RSD=5.09%;200μg/ml的平均回收率(94.83±4.56)%，RSD=4.81%。

3 结果

3.1 日间差、日内差 用空血浆配制头孢吡肟0.5，10，200 μg/ml三个浓度的血样，按“2.2”项下处理，进样，经2010系统工作站，计算头孢吡肟与头孢曲松的峰面积比。日内差(间隔1 h，n=5)与日间差(间隔24 h，n=6)，结果见表2。

表2 日间差、日内差

由表2可知日内差、日间差的相对标准差均小于10%，表明实验方法相对稳定。

3.2 轻度烧伤组和中度烧伤组的头孢吡肟的血药浓度 将轻度烧伤感染组和中度烧伤感染组的血浆样品按2.2项下处理，进样，经2010系统工作站，按内标峰面积标准曲线法自动求得样品含量，头孢吡肟的血药浓度见表3。

表3 轻度烧伤组和中度烧伤组头孢吡肟的血药浓度

头孢吡肟在轻度烧伤组和中度烧伤组的血药浓度按成组比较，经SPSS8.0统计学软件处理，两组差异有统计学意义(P＜0.05)。提示:中度烧伤患者头孢吡肟的代谢或消除大于轻度烧伤感染，故应适当缩短中度烧伤感染患者的头孢吡肟的滴注的间隔时间或增大其用药剂量。

4 讨论

4.1 从表2结果可知，中度烧伤组的头孢吡肟血药浓度显著低于轻度烧伤组(P＜0.05)，这可能与中度烧伤患者的药物蛋白结合率有关［3］。

4.2 本文提示缩短中度烧伤感染患者的头孢吡肟的滴注的间隔时间或增大其用药剂量结论，主要是因为中度烧伤的药血浓度因烧伤的因素增加了药物的代谢，故需了通过调整用药剂量或增加用药频次的给药方案提高该类患者的血药浓度。

4.3 本实验在测量样品时采用了简易的离心生物样品处理法，该步骤有赖于柱切换液相色谱法的特点，回避了单纯HPLC法因蛋白质与流动相中的有机溶剂发生反应、导致沉淀，堵塞色谱柱，故不能直接进样的缺点［4］。

4.4 HPLC柱切换法的原理是:样品中的蛋白质及其他内源杂质受亲水性外表面的作用和孔径大小的限制，被预处理流动相直接洗脱出来，而样品中的被测物在洗脱至分析柱之前被吸附在填料间隙中，得以净化和富集，然后切换至并分析柱相连接，用分析流动相将被测物从预柱洗脱出至分析柱，进行分离测量。从而提高了分离和检测效率。

［1］ Loirat P J，Rohan A.Baillet F，et al.Increased glomerular filtration rate in patients with major burns and itseffect on the pharmacokinetics of tobramycin N Engl JMed，1978，299:915-919．

［2］ Sanders，CC．Cefepime:the next generation?Clin Infect Dis，1993，17:369-379．

［3］ Martyn，J A J，D R Abernethy，D J Greenblatt．Plasma protein binding of drugs after severe burn injury.Clin.Pharmacol.Ther，1984，35:535-539．

［4］ 顾云.柱切换HPLC技术在生物样品测定中的应用.天津药学，2003，15(2):80-82．