大鼠伏核内注射吗啡及其受体阻断剂对其Nogo-A和CGRP mRNA表达的影响

王 燕，孟 蒂，李 宁

(潍坊医学院应用药理学实验室，山东潍坊 261053)

NAc是脑奖赏通路的重要核团，并在痛觉调制过程中发挥重要作用。Nogo-A是新发现的一类抑制受损轴突再生的抑制性蛋白，广泛分布于中枢和外周神经系统［1－2］。Nogo-A存在于与痛觉调制有关的脑区［3］，提示Nogo-A可能参与了痛觉调制过程，但相关研究很少。CGRP是1982年发现的一种生物活性多肽，广泛分布于中枢、外周神经系统及其它外周组织，且在与痛觉密切相关的脑区有表达，如NAc、中脑导水管灰质和杏仁核等部位。近年来的研究证实:在NAc内CGRP与内源性阿片系统共同参与了痛觉的调制过程。我们的研究发现脑内Nogo-A也与痛觉调制过程有关。进一步证实并阐明Nogo-A参与痛觉调制过程及其作用，对于丰富中枢痛觉调制理论具有重要意义。

1 材料与方法

1.1动物健康SD大鼠(♂，280～320 g)，由山东鲁抗提供(许可证号:SCXK鲁2008 0002)。

1.2主要药物和试剂UNIQ-10柱式总RNA抽提纯化试剂盒、AMV第一链cDNA合成试剂盒、PCR(Taq)扩增试剂盒和引物合成均为上海生工生物工程有限公司产品。盐酸纳洛酮(批号:20081108，北京凯因科技股份有限公司);硫酸吗啡注射液 (批号:20070417，青海制药厂有限公司)。

1.3行为药理学实验

1.3.1 术前准备(训练大鼠)术前对大鼠进行热板测试训练，以使动物对热刺激的反应较为平稳。训练持续进行5 d，训练后大鼠后爪缩爪反应的潜伏期(hindpaw withdrawal lantecy，HWL)平均在3～5 s。

1.3.2热板测试实验(hot-plate test)方法热板(YLS-6A型智能热板仪，山东省医学科学院设备站)温度维持在52℃左右(51.7℃ ～52.3℃)。手握住大鼠身体，将待测后爪放在热板上，稍加压力，使其后爪的掌部紧贴热板表面。然后踩下脚踏开关，仪器开始计时，当大鼠后爪回缩时，仪器计时停止，记录的时间即为大鼠的HWL。

1.3.3动物分组将热板测试训练后的32只大鼠随机分为4组，其中，空白对照组8只，实验时向NAc内注射等量生理盐水1 μl;福尔马林致炎24只，先分别足掌皮下注射10 g·L－1的福尔马林0.1 ml;致炎成功后再将其等分为3组:痛敏模型对照组、吗啡组和纳洛酮组，分别向NAc核团注射生理盐水、吗啡和纳洛酮各1 μl。

1.3.4脑内埋管手术用戊巴比妥钠40 mg·kg－1腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠头部固定在立体定位仪(SN-2，日本NARISHIGE公司)上，剪去头顶部皮肤及皮下结缔组织，使颅骨充分暴露，在前囟和后囟用墨点做好标记。调整立体定位仪的坐标系统，用骨钻垂直颅骨钻开直径大约为1 mm的圆形孔，将一直径为0.8 mm的不锈钢套管垂直插入右侧NAc上2 mm(B 2.0，L 1.5，H 6.8 mm)，用牙托粉固定。动物手术后需休养2～3 d方能进行行为药理学实验。

1.3.5痛敏模型制作用微量注射器将10 g·L－1福尔马林0.1 ml注入大鼠一侧后爪掌心皮下，5 min后热板测试动物HWL时间(s)。大鼠在注射福尔马林后立即出现舔咬和抬缩后肢，持续3～5 min，注射后15～20 min再次出现上述症状，说明造模成功，随时间推移，注射侧后肢出现红肿，活动轻度受限，说明出现了炎性痛及痛过敏，在3 d后进行核团注射。

1.3.6核团注射实验方法给药前先热板测试大鼠HWL，然后用一根外径0.4 mm的注射管插入埋植好的套管，注射管超出套管末端1 mm，向大鼠NAc注入药物，注射持续时间约为1 min。在给药后5、10、20、30、45、60 min 分别热板测试大鼠的 HWL;实验结束做注射部位鉴定，见Fig 1。

Fig 1 Illustration of the location of the needle tips in the NAc

1.4取NAc区域脑组织核团注射后60 min，将大鼠用戊巴比妥钠40 mg·kg－1麻醉，并固定于脑立体定位仪上。为准确取出NAc区域脑组织，用一段直径0.8 mm的不锈钢针在大鼠脑NAc前 (B 3.0，H 6 mm)、后 (B 0.48，H 6.8 mm)各做一标记，取出脑组织，沿NAc前、后做的标记做冠状切片，用内径1.5 mm的玻璃管，以标记为中心钻孔，取出NAc区域脑组织置于液氮中备用。

1.5 RT-PCR检测Nogo-A mRNA和CGRP mRNA的表达RT-PCR按照上海生工生物工程有限公司试剂盒说明书进行操作。大鼠Nogo-A、CGRP及β-actin的引物序列及片段长度(见Tab 1)，引物合成:查基因库，进行引物设计，由上海生工生物工程有限公司合成。

RT-PCR反应条件:94℃预热变性5 min，94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，扩增40个循环，末次循环后72℃延伸10 min。每个样品均设4个复孔，以保证实验的可重复性。同时做了阴性对照和“no-RT”对照。阴性对照用无RNA酶的水代替RNA模板，“no-RT”对照用无RNA酶的水代替逆转录酶。记录每个样品CT平均值，并用βactin做内参来标准化反应样品的RNA的量。

1.6琼脂糖凝胶电泳分别取5 μl PCR反应产物，加上样缓冲液1 μl，以10×TAE为电泳缓冲液，EB染色鉴定，在20 g·L－1琼脂糖凝胶中电泳约1 h(电压60 V)，将琼脂糖凝胶置于数码成像分析系统(gene genius bio-imaging system，USA)下观察拍片，并观察有无非特异性扩增。

1.7统计学处理采用SPSS 11.0软件进行统计分析，测得数据用±s表示。各组之间用单因素方差分析(ANOVA)进行显著性检验。

2 结果

2.1各组大鼠后爪缩爪潜伏期的变化与空白对照组相比，福尔马林致炎模型组可以明显缩短大鼠后爪对热刺激的HWL(P＜0.05)，该效应在给药后5～15 min最为明显，持续大约60 min;与福尔马林致炎的痛敏模型对照组相比，吗啡组大鼠的HWL(P＜0.01)明显延长，而纳洛酮组大鼠后爪对热刺激的HWL无变化(P＞0.05)。

2.2 Nogo-A mRNA和CGRP mRNA的表达各组大鼠NAc内Nogo-A mRNA与CGRP mRNA均有表达。RT-PCR结果显示，阴性对照和“no-RT”对照未扩增出目标产物，而NAc组织中则扩增出了Nogo-A mRNA与CGRP mRNA的基因片段，表明总反应体系无污染，大鼠NAc内有Nogo-A mRNA与CGRP mRNA的表达。与空白对照组比较，痛敏模型对照组大鼠NAc内Nogo-A mRNA表达量降低(P＜0.05)，CGRP mRNA表达量增高(P＜0.01);与痛敏模型对照组比较，吗啡组Nogo-A mRNA表达量增高(P＜0.01)，CGRP mRNA的表达量降低(P＜0.05)，而纳洛酮组Nogo-A mRNA表达量降低(P＜0.05)，CGRP mRNA 的表达量增高(P＜0.05)，见Tab 2。

Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

Tab 2 Analysis of RT-PCR products in NAc(±s，n=8)

Tab 2 Analysis of RT-PCR products in NAc(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs blank control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs hyperalgesia model control group

CT β-actin/CT CGRP Blank control 13.813 ±0.114 13.605 ±0.106 13.Group CT β-actin CT Nogo-A CT CGRP CT β-actin/CT Nogo-A 751 ±0.087 1.015 ±0.009 1.005 ±0.005 Hyperalgesia model control 13.851 ±0.021 13.774 ±0.134 13.600 ±0.108 1.005 ±0.009* 1.019 ±0.009＊＊Morphine 13.852 ±0.061 13.574 ±0.100 13.834 ±0.240 1.021 ±0.006## 1.002 ±0.018#Naloxone 13.837 ±0.085 13.920 ±0.141 13.837 ±0.051 0.994 ±0.009# 1.036 ±0.020#

琼脂糖凝胶电泳证明，在采用3对引物进行的RT-PCR实验过程中均有特异性DNA扩增产物，阴性对照和“no-RT”对照未出现特异性DNA扩增产物(Fig 2)。

Fig 2 Agarose gel electrophoresis result of RT-PCR products in NAc

3 讨论

NAc是中脑-边缘多巴胺系统环路的重要核团，NAc内有丰富的阿片肽能神经纤维和各种类型的阿片受体，刺激NAc能引起痛阈的升高。NAc联系纤维分为内、外侧两部分，其内侧部主要走向终纹、丘脑、大脑水管周围和中脑腹侧;外侧部趋向嗅结节、前穿质等脑底结构［4］。目前研究表明NAc与镇痛、药物成瘾、行为调控、学习记忆、心血管活动等功能的调节有关。

本实验所采用的福尔马林痛敏模型是伤害作用的标准动物模型之一，其疼痛过程表现为双相伤害性反应:第1时相在注射后立即发生，表现为舔咬和抬缩后肢，持续3～5 min;第2时相出现在注射后15～20 min，但上述症状逐渐减弱。虽然动物自发性疼痛行为仅持续60～90 min，但注射侧后肢以及对侧后肢仍对机械和温度伤害性刺激处于过度敏感状态，可持续4周，在福尔马林注射后3 d炎症最明显［5］。

CGRP是一种神经递质，有强心、扩张血管和促进血管新生［6］的作用，是目前发现的最强大的内源性舒血管物质。近年来CGRP在痛觉调制方面研究比较多，现已证实CGPP参与了杏仁体、大脑水管周围灰质的痛觉调制并发挥重要作用［7－8］，CGRP 及其受体在炎症反应及NAc痛觉调制过程中也发挥着重要作用［9－10］，它可以通过多种途径促进伤害性信息的传递与痛觉过敏的产生。此外，CGRP的表达与内源性阿片系统也存在一定的联系［11－12］。Nogo蛋白是近年来新发现的一种中枢神经再生抑制因子，有3种同源异构体:Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C。Nogo蛋白羧基端与神经内分泌特异性蛋白和内质网浆膜蛋白家族高度同源，都具有一个双赖氨酸的内质网保守基序，可能是内质网的保守信号［13］。目前关于Nogo-A功能研究最多的是其在神经再生方面的作用。Nogo-A样免疫反应产物广泛分布于大鼠中枢神经系统的神经元及其纤维，在NAc有中等强度的Nogo-A阳性神经元和纤维［3］。Nogo-B普遍存在于各种组织，调节血管动态平衡和重构，也可能参与了诱导凋亡［14－15］;Nogo-C 主要在肌肉表达［16］，其具体作用机制有待进一步研究。

本实验用RT-PCR方法证实大鼠致炎产生痛敏后，NAc内Nogo-A和CGRP mRNA的表达量发生了相互变化，提示:它们可能在该区域都参与了痛觉调制过程，且二者呈反向调节;在痛敏模型大鼠NAc内注射吗啡，其Nogo-A mRNA的表达与痛敏模型对照组比较明显增加，同时这种作用可被阿片受体拮抗剂纳洛酮所取消。结果提示在大鼠NAc内Nogo-A、CGRP及内源性阿片系统在痛觉调制方面存在着相互影响。然而，痛觉调制是一个复杂的过程，其具体机制及相关递质的表达研究目前尚未明了，本实验结果进一步丰富了痛觉调制理论，还可能为寻找治疗疼痛的新途径、新方法和新的药物靶点提供新的研究方向。

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