穿孔膜片钳方法记录L型钙通道及脱氢紫堇碱对其影响的研究

孟红旭，王 宝，刘建勋

(中国中医科学院西苑医院实验研究中心，北京 100091)

在采用全细胞膜片钳技术对L型钙通道电流记录时，L型钙通道电流会发生随时间的经过而逐渐减小的“rundown”现象，对观察药物对L型钙通道效应造成很大影响。而穿孔的膜片钳方法的使用减少了“rundown”现象的发生。此文比较了全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法记录L型钙通道电流随时间经过的变化差异，并观察了脱氢紫堇碱(dehydrocorydaline，DHC)对L型钙通道的影响。

1 材料与方法

1.1心室肌细胞的分离采用急性酶分法获得单个心室肌细胞［1］。

1.2膜片钳技术通过电极拉制仪(PULL-100，美国)拉制电极，选择杆状、表面光滑、纹理清晰的心肌细胞，利用三维操纵器移动电极贴近目标细胞，并轻压在细胞表面，稍加负压即可形成1 GΩ水平以上的高阻抗封接，再用较大负压吸破细胞膜，形成普通的全细胞记录形式。穿孔膜片钳技术需要在电极内液中充入两性霉素B(0.2～0.3 g·L－1，Sigma)，移动电极贴近目标细胞，并轻压在细胞表面，稍加负压，几分钟内可见系统阻抗逐渐降低，至100 MΩ左右形成稳定穿孔。实验过程由刺激采集软件Pulse控制，经膜片钳放大器 (EPC10，德国)，通过模数转换采集数据，存放于计算机硬盘。

1.3L-型钙通道电流记录方法将细胞钳制在－40 mV使钠通道和T型钙通道失活，电极内液用CsCl代替KCl阻断K+电流外流。给予从－40mV至0mV持续250 ms的除极电压，可以得到迅速活化缓慢失活的内向电流，能够被盐酸地尔硫卓(10 μmol·L－1)阻断［2］，确定为 L 型钙通道电流。根据实验情况分别采用全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法每隔10、15、30 s给予上述除极电压连续记录15 min以上。L型钙电流峰值幅度取电流活化峰值点与失活后电流轨迹的垂直距离。

1.4药物和配制液体

1.4.1药物人参皂苷Re由中国药品生物制品检定所购置，批号:1107054-200421;脱氢紫堇碱由中国中医科学院西苑医院实验中心提供;配液所需药品由英国Alfa Aesar公司购置。

1.4.2配制液体(mmol·L－1)无钙台式液:NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，MgCl21，Glucose 10，Hepes 10(pH 7.4 NaOH);KB液:KOH 70，KCl 40，KH2PO420，Glutamic acid 50，MgCl23，Taurine 20，EGTA 0.5，Hepes 10，Glucose 10(pH 7.4 KOH);细胞外液:台式液(无钙台式液 +CaCl21.8);电极内液:CsCl 140，MgCl22，CaCl21，EGTA 11，MgATP 5，Hepes 10(pH 7.2 CsOH)

1.5数据处理所有数据采用同一细胞给药前后比较，用±s表示。所获数据采用组间t检验。

2 结果

2.1采用全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法记录L－型钙通道电流随时间经过的比较普通的全细胞膜片钳方法记录的L型钙通道电流“rundown”现象非常明显，电流峰值随时间经过出现明显衰减，15 min内衰减幅度能达到初始值的(34±23)%(n=10)。Fig 1A、C显示了一例采用普通的全细胞膜片钳方法每隔10 s给予除极刺激电压连续记录15 min L型钙通道电流随时间经过的变化情况:C图显示15 min内电流峰值幅度随时间经过逐渐衰减，a，b，c，d 分别是1、6、11、15 min 时间点的电流峰值，而对应这些时间点的电流轨迹则在A图显示。这例细胞的电流峰值在15 min时衰减了30%。Fig 1B、D显示了一例采用穿孔膜片钳方法的记录:这例细胞的电流峰值在15 min时几乎没有衰减，a，b，c，d 分别显示1、6、11、15 min时间点的电流轨迹和峰值。采用穿孔全细胞膜片钳方法对10个细胞的观察发现:电流峰值在15 min内的衰减幅度为(2.7±3.4)%，甚至一些细胞的电流峰值还略有升高。获得两组数据经组间t检验P＜0.01，差异有显著性。同时我们发现穿孔膜片钳方法记录到的L型钙通道电流的失活速度明显快于普通全细胞的记录。

2.2采用全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法观察人参皂苷Re对L型钙通道电流的抑制效应人参皂苷Re是人参的一种有效成分，有报道其对豚鼠心室肌细胞L型钙通道电有抑制作用［3］，本研究使用它来观察全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法在记录药物抑制效应中的差异。Fig 2A、C显示一例采用普通全细胞膜片钳方法连续记录给予人参皂苷Re(100 μmol·L－1)后L型钙通道电流随时间经过的变化情况:A图为电流轨迹的变化，C图为电流峰值幅度的改变。a，b，c分别显示给药前、给药中、洗脱后3种状态。由于给药前后电流峰值抑制处于衰减状态，无法判断人参皂苷Re是否具有抑制效应。在记录的其他5个细胞中都出现与图例相同的情况。而采用穿孔全细胞膜片钳方法记录的5个细胞中，给予人参皂苷Re后电流峰值逐渐被消减，药物洗脱后被消减的峰值逐渐恢复，经过统计人参皂苷Re(100 μmol·L－1)对 L型钙通道电流的抑制率为(77.4±6.68)%。Fig 2B、D是一例采用穿孔全细胞膜片钳方法连续记录的给予人参皂苷Re前后通道电流的变化状况。a、b、c分别是给药前、给药中、洗脱后电流的电流峰值和电流轨迹。

2.3采用穿孔膜片钳方法观察脱氢紫堇碱对L型钙通道的影响脱氢紫堇碱是中药元胡的一种有效成分，具有抗心肌缺血作用。我们采用穿孔膜片钳方法记录了脱氢紫堇碱(10，100 μmol·L－1)对 L型钙通道电流峰值的影响。Fig 3显示一例给与脱氢紫堇碱前后通道电流随时间经过的变化状况，低浓度药物能够轻微消减电流峰值，高浓度的药物对电流峰值的消减非常明显，药物洗脱后电流几乎完全恢复。a，b，c分别显示了是给药前、给药中电流峰值和电流轨迹。脱氢紫堇碱(10，100 μmol·L－1)对其他细胞也表现出抑制效应，对L-型钙通道I电流峰值的抑制率分别为(9±7.5)%(n=5)和(28.6±8.5)%(n=5)，两组数据经组间t检验P＜0.01，差异有显著性，显示这种抑制效应具有浓度依赖性。

Fig 1 Changes of L-type calcium channel currents curve(over)and current peak(under)over time through recorded by whole cell patch clamp(A，C)and perforated patch clamp method(B，D)

3 讨论

由于L钙通道开闭受细胞内磷酸化的调节明显，因此采用全细胞方法记录“rundown”现象比较明显。本研究结果显示这种电流衰减对药物作用的观察产生很大影响。采用穿孔的膜片钳技术能够将钙电流衰减率从30%减少到10%以内，并能够稳定记录对中药有效成分人参皂苷Re抑制效应，表明穿孔膜片钳方法在记录L型钙通道电流记录方面具稳定性和准确性，较全细胞膜片钳方法更适合对药物作用进行观察。一些具有抗心肌缺血的中药有效成分具有钙通道抑制剂的作用［4－6］，这些有效成分对钙通道作用途径似乎与临床常用的钙拮抗剂直接作用于钙通道蛋白不同，而是通过一些细胞转导途径发挥抑制效应［1，7］。穿孔膜片钳技术是在保持心肌细胞内容物保持相对稳定的条件下实施，因此更适合研究中药有效成分对钙通道的影响。

Fig 2 Effect of ginsenoside Re on L-type calcium channel currents recorded by whole cell patch clamp(A，C)and perforated patch clamp method(B，D)

Fig 3 Effect of Dehydrocorydaline(DHC 10，100 μmol·L －1)on L-type calcium channel currents recorded by perforated patch clamp method

中药元胡中一种生物碱脱氢紫堇碱具有抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用，并且在正常氧和低氧条件下能够阻止心肌细胞内钙超载［8－9］，本研究结果显示脱氢紫堇碱能够浓度依赖性的抑制L型钙通道提示脱氢紫堇碱抗心肌缺血作用的机制可能是通过抑制L型钙通道的开放减少钙内流而抑制钙超载，减轻心肌缺氧/复氧损伤。

［1］汪玲芳，尹永强，赵 临，等.牛磺酸镁对乌头碱致大鼠心肌细胞心律失常模型钠离子通道的影响［J］.中国药理学通报，2010，26(5):611－4.

［1］Wang L F，Yin Y Q，Zhao L，et al.Effects of taurine-magnesium coordination compound on sodium channel in rat cardiomyocytes of arrhythmia induced by aconitine［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(5):611－4.

［2］金松南，金景玉，苏延友，文今福.钙通道阻滞剂对甲亢性高血压大鼠胸主动脉舒张反应的影响［J］.中国药理学通报，2009，25(12):1615－8.

［2］Jin S N，Jin J Y，Su Y Y，Wen J F.Vasorelaxant effects of calcium channel blockers on isolated thoracic aortic rings from thyrox-ine-induced hypertensive rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(12):1615－8.

［3］Takahashi K，Masumiya H，Sawanobori T，et al.Nitric oxide-dependent modulation of the delayed rectifier K+current and the L-type Ca2+current by ginsenoside Re，an ingredient of Panax ginseng，in guinea-pig cardiomyocytes［J］.Br J Pharmacol，2004，142(3):567－75.

［4］张广钦，郝雪梅，陈世忠，等.芍药苷对大鼠心肌细胞L钙通道的阻断作用［J］.中国药理学通报，2003，19(8):863 －6.

［4］Zhang G Q，Hao X M，Chen S Z，et al.Blockade of paeoniflorin on L-type calcium channel in isolated rat ventricular myocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(8):863 －6.

［5］刘爱华，张志雄.银杏酮酯对缺血豚鼠心室肌细胞Ⅰ(Ca-L)和游离钙的影响［J］.中国药理学通报，2010，26(3):329 －33.

［5］Liu A H，Zhang Z X.Effect of GBE50 on L-type calcium current and cytosolic［Ca2+］iin ischemic guinea pig ventricular myocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):329 －33.

［6］陈江斌，黄从新，唐其柱，等.山莨菪碱对家兔心室肌细胞L-型钙通道的影响［J］.中国药理学通报，2000，16(2):162－4.

［6］Chen J B，Huang C X，Tang Q Z，et al.Effects of anisodamine on L-type calcium channels of rabbit ventricular myocardium［J］.Chin Pharmacol Bull，2000，16(2):162 －4.

［7］易方方，唐其柱，冯斯婷，王 腾.白藜芦醇经蛋白激酶G影响豚鼠心室肌细胞 L-型钙通道［J］.中国病理生理杂志，2007，23(4):648－51.

［7］Yi F F，Tang Q Z，Feng S T，Wang T.Effects of resveratrol on the L-type calcium current by protein kinase G pathway in isolated guinea pig ventricular myocytes［J］.Chin J Pathophy，2007，23(4):648－51.

［8］孙宇扬，刘建勋，吴晓洋，等.双参宁心方血清药物化学和抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的实验研究［J］.中国中医药信息杂志，2006，13(5):36 －7.

［8］Sun Y Y，Liu J X，Wu X Y，et al.Study on serum pharmacochemistry of Shuangshenningxin Fang and its protective effects on cultured cardiomyocytes injured by hypoixa and reoxygenation［J］.Chin J Infor Tradit Med，2006，13(5):36 －7.

［9］赵 昕，汤 浩，王亚杰，等.脱氢紫堇碱对正常和低氧豚鼠心肌细胞内钙的影响［J］.中国应用生理学杂志，2003，19(3):222－5.

［9］Zhao X，Tang H，Wang Y J，et al.The influence of dehydeocorydaline on intracellular free calcium concentration during hypoxia in myocardial cell of guinea-pigs［J］.Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi，2003，19(3):222 －5.