氧化槐定碱镇痛作用及其对小鼠中枢GABAARα1表达的影响

杨 光，闫 琳，高进贤，易正洪，蒋袁絮

(1.宁夏医科大学基础医学院，宁夏回药现代化工程技术研究中心，宁夏银川 750004;2.甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000)

氧化槐定碱(oxysophoridine，OSR)是从苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)中提取的主要生物碱之一［1］。本室前期研究发现OSR在热板和福尔马林两种致痛模型中均具有一定的镇痛作用，镇痛作用部位涉及中枢和外周［2］。侧脑室注射OSR能明显增加大鼠皮层、海马γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)免疫阳性细胞数目，下调GABA转运体(GABA transporter-1，GAT-1)的基因表达［3-4］。本文在前期研究的基础上进一步探讨OSR(iv)的镇痛作用以及GABAA受体在OSR镇痛中的作用。

1 实验材料

1.1动物昆明种小鼠，♀♂ 兼用，体质量18～22 g，宁夏医科大学实验动物中心提供〔合格证号:SCXK(宁)2005-001〕。小鼠分笼饲养，温度20～22℃，相对湿度50% ～60%，光照明暗各12 h。

1.2药品及试剂OSR:宁夏紫荆花药业公司，批号:071217;盐酸吗啡注射液(morphine，Mor):沈阳第一制药厂，批号051106，使用前均用生理盐水溶解，置4℃冰箱备用。多克隆羊抗GABAARα1抗体购自美国Santa Cruz公司，生产批号:J0509;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG:北京中杉生物技术有限公司，批号:86531;辣根酶标记兔抗山羊IgG(H+L):北京中杉生物技术有限公司，批号:86531。

1.3主要仪器和设备DK-420S型三用恒温水箱;上海精宏试验设备有限公司;100LAP/SPLIT MENMORY电子秒表:日本;凝胶成像仪:美国Bio-RAD公司;高速低温离心机:美国 Bio-RAD公司;SDSPAGE电泳仪:美国Bio-RAD公司;转移电泳仪:美国Bio-RAD公司;实时定量PCR仪:美国Bio-RAD公司;DYY-Ⅲ电泳仪:北京六一仪器厂。

2 实验方法

2.1温浴法痛阈测定依照Luttinger［5］关于温浴法测定的描述进行操作，于给药后 10、20、30、45、60、90min测定痛阈变化，并按下式计算痛阈提高率。

2.2给药方法及分组小鼠50只，♀♂ 兼用，随机分为5组:空白对照组(NS组);阳性对照组(Mor 40.0 mg·kg-1)和 OSR(500.0，250.0，125.0 mg·kg-1)组，每组10只。除吗啡采用腹腔注射(intraperitoneal injection，ip)外，其余均为 iv，容量为 0.1 ml/10 g，空白对照组给予等容量NS。分别测定各组给药前、后小鼠甩尾潜伏期。

2.3荧光实时定量PCR方法检测GABAARα1基因小鼠42只，♀♂兼用，按取材部位不同分为脊髓组和脑组。脊髓组小鼠21只，随机分成3组，每组7只:空白对照组(NS)、模型对照组(福尔马林，Formalin)、OSR组。Formalin组和OSR组分别给予NS(0.1 ml/10 g，iv)和 OSR(500.0 mg·kg-1，iv)35 min 后，小鼠足下注射 2%Formalin 20 μl，30 min取脊髓(腰膨大)。脑组小鼠分组及给药同脊髓组，3 h 取脑(去小脑);常规 RNA 提取，0.067 mol·L-1琼脂糖凝胶电泳实验检测RNA质量后用RNA反转录试剂盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix)将RNA反转录成cDNA后用TransStart Green qPCRSuperMix试剂盒进行荧光实时定量PCR反应，以基因相对表达量为指标检测OSR对Formalin致痛小鼠脊髓和脑GABAARα1 mRNA表达的影响，GABAARα1和内参引物 GAPDH均依据 NCBI GenBank中小鼠GABAARα1和GAPHD基因序列号由上海生工生物工程有限公司设计、合成，基因序列如下:GABAARα1:(f):5'CAAGTCTCCTTCTGGCTCAAC3';(r):5'TTTACTGTGGCAAACTCAATC3';产物长度:200 bp;退火温度:52。GAPDH:(f):5'AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG3';(r):5'AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG3'。产物长度:294 bp;退火温度:52。

2.4Western blot法检测GABAARα1蛋白动物分组及给药同“2.3”，1.5 h 取脊髓、4 h 取脑(去小脑)，RIPA裂解液提取蛋白，经考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，电转移至硝酸纤维素膜(300 mA，90 min)，5%脱脂奶粉4℃封闭2 h，多克隆羊抗GABAARα1抗体(1∶600)，4℃孵育过夜，PBST洗膜3次后加上辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶3 000)4℃孵育3 h，PBST次洗膜3次后，利用Western blot荧光试剂(Ecl)进行化学曝光，按标准程序显影、冲洗胶片，采用凝胶图像分析成像系统对图片上每个特异条带进行扫描分析，得出目的条带面积灰度值。以目的蛋白的灰度值比内参GAPDH的灰度值校正误差，所得结果代表样品的目的蛋白相对含量。以蛋白相对表达量检测OSR对Formalin致痛小鼠脊髓和脑GABAARα1蛋白表达的影响。

2.5统计学方法实验结果采用SPSS11.5统计软件包进行分析，数据采用形式表示，各组之间的统计学差异分析选用方差分析(One-way ANOVA)和t检验。

3 结果

3.1OSR对小鼠热甩尾痛阈的影响Mor(40 mg·kg-1，ip)可使小鼠热甩尾潜伏期明显延长(P＜0.01)，作用持续90 min以上。与给药前及NS组比较，OSR(500、250 mg·kg-1，iv)能明显延长小鼠热甩尾潜伏期(P＜0.05、P＜0.01)，镇痛作用可持续60 min以上，最大痛阈提高率可达59.82%(Tab 1)。

3.2OSR对福尔马林致痛小鼠脊髓和脑GABAARα1mRNA表达的影响

3.2.1紫外分光光度法测定RNA浓度及纯度所抽提的RNA光密度(OD)值A260/280均在1.8到2.0之间，琼脂糖凝胶电泳检测可见3条明显的RNA 特征条带:5 S、18 S、28 S，反转录所得cDNA 特异性强、质量好，GAPDH和GABAARα1定量PCR产物熔解曲线峰值均一、在反应曲线的其它位置未见到明显波形(Fig 1～3)。

Fig 1 Agarose gel electrophoresis result of total RNA in brain and spinal cord

Fig 2 Cumulative results of GAPDH and GABAARα1(n=7)

Fig 3 Solubility curve of GAPDH and GABAARα1(n=7)

3.2.2OSR对福尔马林致痛小鼠脊髓和脑GABAARα1 mRNA表达的影响与 Formalin组比较，OSR(500.0mg·kg-1，iv)可明显抑制福尔马林诱导的GABAARα1 mRNA相对表达量的下调，提高小鼠脊髓和脑 GABAARα1 mRNA表达(P＜0.01)(Fig 4)。

Tab 1 Influence of OSR(iv)on the tail-flick latency in the warm water tail-flick test in mice(±s，n=10)

Tab 1 Influence of OSR(iv)on the tail-flick latency in the warm water tail-flick test in mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs pre-dose

NS 3.49 ±0.83 3.30 ±1.16 3.54 ±1.39 3.63 ±1.25 3.83 ±1.71 3.72 ±2.20 3.27 ±1.14 Mor 40.0 3.44 ±1.07 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 15.0 ±0.0＊＊## 14.5 ±0.96＊＊##OSR 500.0 3.49 ±0.87 7.02 ±1.01＊＊##10.38 ±1.44＊＊##9.47 ±1.54＊＊##8.11 ±1.40＊＊##7.27 ±1.92＊＊##3.25 ±0.81 250.0 4.08 ±1.68 4.08 ±1.69 7.82 ±1.85＊＊##7.72 ±1.90＊＊##6.37 ±1.92＊＊##5.23 ±2.68*# 4.18 ±1.50 125.0 3.37 ±0.89 4.08 ±1.17 3.64 ±1.11 4.23 ±1.31 4.44 ±1.64*#4.07 ±1.73 3.23 ±0.78

Fig 4 Effect of OSR(500.0 mg·kg－1，iv)on GABAARα1 mRNA expression measured by quantitative real-time PCR(±s，n=7)

3.3OSR对福尔马林致痛小鼠脊髓和脑GABAARα1蛋白表达的影响与Formalin组比较，OSR(500.0 mg·kg-1，iv)可使小鼠脊髓和脑GABAARα1蛋白表达量明显提高(P＜0.01)，提示OSR可明显抑制福尔马林诱导的GABAARα1蛋白表达量的下调(P＜0.01)(Fig 5～7)。

Fig 5 Agarose gel electrophoresis result of GABAARα1 protein expression in spinal cord

4 讨论

Fig 6 Agarose gel electrophoresis results of GABAARα1 protein expression in brain

Fig 7 Effect of OSR(500.0 mg·kg－1，iv)on GABAARα1 Protein expression measured by Western blot(±s，n=7)

GABA是中枢神经系统中主要的抑制性氨基酸类神经递质，广泛存在于痛觉传导通路上，通过与GABAA受体结合而开放其偶联的氯离子通道，胞外氯离子内流增加使膜超极化，产生抑制性突触后电位，进而引起包括镇痛在内的多种中枢抑制作用［6～8］。电生理学实验证明 GABA作用于 GABAA受体通过影响大鼠伏核中痛兴奋神经元和痛抑制神经元的放电活动而产生镇痛作用［9］，由GABAA受体介导的大鼠三叉神经节神经元GABA激活电流(IGABA)能被GABAA特异性拮抗剂荷包牡丹碱(Bicuculline，BIC)阻断［10］。在脊髓以上水平有大量的GABA能神经元，它们在抗伤害性刺激和促伤害性刺激中有重要作用。GABA介导的神经元活动在中脑导水管周围灰质腹外侧区(PAG)和延髓头端腹内侧核群(RVM)的固有神经环路中可调节从PAG和RVM发出的内源性痛觉下行抑制系统的功能，而GABAA受体参与了其对内源性痛觉下行抑制系统复杂的调控作用。在大鼠的RVM或PAG给予GABAA受体兴奋剂或拮抗剂可产生抗伤害或促伤害性刺激作用(即致痛敏作用)［11］。脊髓是接受疼痛信息的初级中枢，也是中枢对伤害性信息进行加工处理的重要部位，传递伤害性信息的Aδ类纤维和C类纤维多终止于此。GABA免疫阳性细胞在脊髓各层面都有表达，其中脊髓Ⅰ、Ⅲ层密度最高。本实验结果与文献报道［12］均显示福尔马林所致疼痛刺激可改变脊髓GABAA受体基因和蛋白表达，提示GABA受体系统在感觉和痛觉过程中起到调节作用。有研究表明，脊髓GABA能神经元的减少会减弱调节痛觉的抑制性信号的传导，从而使痛觉传导通路上脊髓神经元兴奋性增强，引起神经痛。而神经痛早期给予GABAA受体激动剂，可减少异位放电向中枢传递，预防神经痛发生，提示GABAA受体激动剂作用于受损大鼠脊髓背根神经节对神经痛有一定的抑制效果［13-14］。

本实验结果显示 OSR(500.0、250.0 mg·kg-1，ith)能明显延长小鼠热甩尾潜伏期(P＜0.05、P＜0.01)，实时荧光定量PCR和Western blot方法检测结果显示OSR(500.0 mg·kg-1，iv)可改善福尔马林所致小鼠脊髓和脑GABAARα1 mRNA和蛋白表达的减少 (P＜0.05，P＜0.01)。以上结果提示OSR具有明显的镇痛作用，小鼠脊髓和脑GABAARα1受体上调是OSR镇痛作用的机制之一。关于中枢GABA能神经参与OSR镇痛作用的详细机制有待进一步研究。

［1］钟仁山.苦豆子的研究应用［M］.银川:宁夏人民出版社，1985:10-20.

［1］Zhong R S.Research and Application of Sophora alopecuroidles L.［M］.Yinchuan:Ningxia People's Publishing House，1985:10-20.

［2］姚婉霞，周俊俊，闫 琳，等.氧化槐定碱镇痛作用及其机制研究［J］.中草药，2008，39(4):569-71.

［2］Yao W X，Zhou J J，Yan L，et al.Analgesic effect of oxysophoridine and its mechanism［J］.Chin Trad Herbal Drugs，2008，39(4):569-71.

［3］余建强，蒋袁絮.槐定碱对大鼠中枢谷氨酸及氨基丁酸免疫阳性细胞的影响［J］.中药药理与临床，2006，10(19):1611-4.

［3］Yu J Q，Jiang Y X.The effects of sophoridine on the positive cells Glu and GABA immunoreactions in CNS of rats［J］.Pharmacol Clin Chin Mater Med，2006，10(19):1611-4.

［4］高进贤，陶丽君，余建强，等.氧化槐定碱镇痛作用及其对小鼠中枢PKCγ表达的影响［J］.中国药理学通报，2009，25(11):1453-6.

［4］Gao J X，Tao L J，Yu J Q，et al.The analgesic action of oxysophoridine and its effect on the expression of PKCγ in central nervous system of mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(11):1453-6.

［5］Luttinger D.镇痛药物实验法［M］//徐叔云，卞如濂，陈 修，主编.药理实验方法学.2版.北京:人民卫生出版社，1991:695-9.

［5］Luttinger D.Analgesic drug experimentation［M］//Xu S Y，Bian R L，Chen X，Chief ed.Pharmacology experiment methodology.2ed edition.Beijing:People’s Medical Publishing House，1991:695-9.

［6］Rudolph U，Möhler H.GABA-based therapeutic approaches:GABAAreceptor subtype functions［J］.Curr Opin Pharmacol，2006，6(1):18-23.

［7］Mirza N R，Munro G.The role of GABA(A)receptor subtypes as analgesic targets［J］.Drug News Perspect，2010，23(6):351-60.

［8］Michels G，Moss S J.GABAAreceptors:properties and trafficking［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，2007，42(1):3-14.

［9］许 艳，徐满英.伏核注射γ-氨基丁酸对大鼠伏核痛反应神经元放电的影响［J］.中国疼痛医学杂志，2005，11(6):349-53.

［9］Xu Y，Xu M Y.Effects of γ-aminobutyric acid injected into nucleus accumbens on the electric activities of pain-related neurons in the nucleus accumbens in rats［J］.Chin J Pain Med，2005，11(6):349-53.

［10］周 莹，刘长金，李 爱，等.大麻素对大鼠三叉神经节神经元γ-氨基丁酸激活电流的抑制作用［J］.华中科技大学学报(医学版)，2007，36(5):561-6.

［10］Zhou Y，Liu C J，Li A，et al.Inhibition of GABA-activated currents by cannabinoids in rat trigeminal neurons［J］.Acta Med Univ Sci Technol Huazhong，2007，36(5):561-6.

［11］王擒云，杨建平，冯昌栋，戴体俊.延髓头端腹内侧核群的GABAA受体部分介导丙泊酚在中脑导水管周围灰质腹外侧区诱发的痛觉过敏作用［J］.苏州大学学报(医学版)，2010，30(5):907-14.

［11］Wang Q Y，Yang J P，Feng C D，Dai T J.Partial Mediation Effect of GABAAreceptor in the rostral ventromedial medulla on propofol-induced Hyperalgesia at ventrolateral portion of the periaqueductal gray of rats［J］.Suzhou Univ J Med Sci，2010，30(5):907-14.

［12］孟 春，王国林，梁 禹.γ-氨基丁酸及其受体在大鼠脊髓疼痛传导通路中的表达［J］.中国现代医学杂志，2010，20(16):2416-20.

［12］Meng C，Wang L G，Liang Y.Expression of GABA and its receptors in spinal dorsal horn of painful rats［J］.Chin J Mod Med，2010，20(16):2416-20.

［13］余开峰，李颖波，冉 然.γ-氨基丁酸及其受体在慢性神经病理痛大鼠背根神经节中的表达及意义［J］.湖北医药学院学报，2011，30(1):5-7.

［13］Yu K F，Li Y B，Ran R.Significance and expression of γ-GABA and its receptor in dorsal root ganglion of rats with neuropathic pain［J］.J Hubei Univ Med，2011，30(1):5-7.

［14］程 伟，文 静，戴体俊，季 永.GABA的镇痛、催眠、遗忘作用及其与GABAA受体的关系［J］.中国药理学通报，2008，24(6):757-61.

［14］Cheng W，Wen J，Dai T J，Ji Y.Relationship between GABAAreceptor and the analgesic、hypnotic and amnesic effects induced by GABA［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(6):757-61.