结直肠癌与其淋巴结转移癌及结直肠癌细胞上皮-间质转化的对比研究

吴共发 胡洁 王雅娟 赵海燕 韩慧霞

1.南方医科大学基础医学院病理学系，广东 广州 510515；

2桂林市人民医院病理科，广西壮族自治区 桂林 514002

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，肿瘤侵袭、转移是患者死亡的主要原因。已有大量研究表明，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在结直肠癌的侵袭、转移中发挥重要作用，能够发生侵袭转移的癌细胞的EMT特征往往较明显。但有文献报道，能发生远处转移的并不是EMT细胞而是非EMT细胞，EMT细胞只是负责降解细胞周围基质，为非EMT细胞的侵袭、转移开路，最终能在远处部位定植的是非EMT细胞［1］。本研究旨在探讨结直肠癌与其淋巴结转移癌组织及结直肠癌细胞系SW480、SW620的EMT特征差异，期望进一步了解EMT在结直肠癌侵袭、转移中的作用。

1 资料和方法

1.1 材料

浓缩型鼠抗人E-cadherin、vimentin单克隆抗体、即用型二步法(PV9000)免疫组化广谱检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉公司；RPMI1640培养基购自莱德尔生物公司；新生牛血清购自吉泰公司；TRIzol试剂购自南京凯基公司；Reverse transcription system试剂盒、SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自TaKaRa公司；E-cadherin、vimentin和GAPDH引物由上海英骏公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人结直肠癌细胞系SW480、SW620购自中国科学院上海生命科学研究院，采用含20%新生牛血清的RPMI1640培养基，37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱内培养。

1.2.2 Real-time RT-PCR检测结直肠癌细胞系中E-cadherin和vimentin的mRNA表达

参照说明书，用 TRIzol试剂常规提取细胞总RNA。按照逆转录试剂盒操作程序进行逆转录反应。反应总体系为20 μL，其中样品总RNA 2 μL，5×Prime Script 4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，Random 6mers 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，DEPC水11 μL。37 ℃反应15 min，85 ℃灭活5 s。 看家基因GAPDH为内对照。通过荧光染料相对荧光定量PCR方法，同时对E-cadherin，vimentin和GAPDH进行检测，计算出不同样本的E-cadherin，vimentin的相对表达量。采用Primer 5.0设计引物，E-cadherin的上游引物为5’-CGGTGGTCAAAGAGCCCTTA-3’，下游引物为5’-TGAGGGTTGGTGCAACGTCGTTA-3’，产物长度为170 bp；vimentin的上游引物为5’-TGAGTACCGGAGACAGGTCGAG-3’，下游引物5’-TAGCAGCTTCAACGCAAAGTTC-3’，产物长度为119 bp；GAPDH上游引物为5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，下游引物为5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’，产物长为259 bp。应用Mx3000P定量PCR仪(Stratagene)进行Real-time PCR实验，反应条件为95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。以Folds=2-ΔΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍数比关系，公式如下ΔΔCt=［Ct(target gene)-Ct(GAPDH)］实验组-［Ct(target gene)-Ct(GAPDH)］对照组［2］。重复3次实验，计算平均值。

1.2.3 免疫组化方法检测E-cadherin和vimentin的表达

30例配对标本取自南方医科大学附属南方医院病理科2007年1月1日—2008年3月1日存档的结直肠癌组织蜡块，每例配对组织均来自同一患者包括原发结直肠癌及其淋巴结转移癌，患者年龄36～85岁，平均58岁。所有组织均用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，3 μm厚切片做免疫组化检测。

免疫组化方法按照试剂盒说明书操作。E-cadherin和vimentin抗体的工作浓度均为1∶50，DAB显色，苏木精复染，中性树脂封固。PBS取代一抗作阴性对照。E-cadherin在细胞膜及少许细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，仅有胞质着色视为阴性，按染色强度及范围分为4级：切片阳性细胞数＜10%为(-)，阳性细胞数10%～＜50%为(+)，阳性细胞数50%～＜90%为(++)，阳性细胞数＞90%为(+++)，(+++)视为表达正常，其他异质性表达均视为表达异常。vimentin 细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，按染色强度及范围分为4级：切片无阳性细胞为(-)，阳性细胞数＜5%为(+)，阳性细胞数5%～＜10%为(++)，阳性细胞数≥10%为(+++)。

1.2.4 HE染色观察结直肠癌与其淋巴结转移癌组织形态

30例配对标本同1.2.3，组织蜡块3 μm厚切片，常规HE染色，采取单盲法由2位初级病理医师初步比较，最后由1位高级职称病理医师审核，光镜下观察比较结直肠癌与其淋巴结转移癌组织形态。

1.2.5 HE染色观察SW48、SW620细胞形态

培养细胞爬片，PBS洗涤3次，每次30 s，95%乙醇固定15 min，PBS洗涤3次，每次30 s，苏木精染色3 min，分化数秒，自来水泡20 min返蓝，伊红1 min，梯度乙醇脱水，每次2 min，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行处理，多组间比较应用Kruskal-Wallis 检验，两组间比较应用Mann-Whitney检验，双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 E-cadherin和vimentin在两细胞系的表达

细胞总mRNA经逆转录成cDNA后，进行Real-time RT-PCR检测。通过对获得的样本Ct值进行相对定量计算分析，结果发现SW620E-cadherin mRNA的表达是SW480的3.18倍，差异具有统计学意义(Z=-2.087，P=0.037)。SW620 vimentin mRNA的表达水平是SW480的6.08倍，差异具有统计学意义(Z=-2.087，P=0.037，图1)。

2.2 E-cadherin、vimentin在结直肠癌与其淋巴结转移癌中的表达

E-cadherin、vimentin在结直肠癌与其淋巴结转移癌中的表达差异无统计学意义(χ2=6.082，P=0.108；χ2=1.597，P=0.660；表1，图2)。在部分淋巴结转移癌患者中E-cadherin的表达高于结直肠癌(4/30)，且vimentin表达比结直肠癌弱，甚至呈表达缺失(6/30；图3)。

2.3 组织形态

结直肠癌与其淋巴结转移癌组织形态具有相似性，淋巴结转移癌的分化程度并不比原发癌差，两者癌细胞形态较类似(图4)。

2.4 细胞分布

光镜观察SW480和SW620细胞分布与排列类似，两者均以纤维母样细胞和有核仁类圆形细胞为主，见散在瘤巨细胞分布，两者形态较类似。

表 1 E-cadherin及vimentin在结直肠癌与其淋巴结转移组织中的表达情况Tab.1 E-cadherin and vimentin expressions in primary colorectal carcinoma and colorectal carcinoma with lymphatic metastasis

3 讨 论

EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转分化的现象。发生EMT时，上皮细胞极性丧失，与周围细胞和基质的接触减少，细胞间的黏附和相互作用减少，而细胞迁移和运动的能力增强，同时细胞表型发生了改变，丧失了上皮表型，如Cytokeratin和E-cadherin表达的逐渐降低，而获得间质表型，如vimentin、Fibronectin及α-SMA的表达等。E-cadherin表达的丢失被认为是EMT最显著的特征之一［3-4］。EMT最初发现于胚胎发育过程中如原肠胚形成，肾器官发育及神经嵴形成［5］。通过大量的研究，EMT被认为是肿瘤演进及转移的基本过程，是低侵袭性肿瘤向高侵袭性肿瘤转换所必需的［6］。但这一普遍被认可的观点近年来却受到了质疑，一个最主要的观点认为肿瘤缺少EMT作用的佐证就是原发性肿瘤与其转移性肿瘤具有组织病理学相似性。为了解释这个明显的矛盾，在转移部位的MET作为一个假设在转移性肿瘤形成过程中被提了出来［7］。根据这个假设，发生EMT的细胞改变它们的黏附性及激活蛋白质分解而具备移动性，允许它们离开原发肿瘤，在远处部位发生继发肿瘤［8］。在远处部位定植过程中，一个逆转的过程——MET发生了，转移性肿瘤重新获得了上皮表型［9］。MET的假设可以很好地解释原发性肿瘤与其转移性肿瘤为何具有组织病理学相似性，而且E-cadherin在肿瘤进展过程中的动态表达也已经有研究记录。但对肿瘤转移过程中，EMT的发生至今仍然缺乏直接实验证据［10-11］。

结直肠癌与其淋巴结转移癌组织中的E-cadherin或vimentin的免疫组化检测已有报道［12-13］，但原发癌和淋巴结转移癌并非都来自同一患者。我们选取的30例结直肠癌与其淋巴结转移癌组织为配对样本，每对样本均来自同一患者，这样的设计更具可比性和严谨性。在我们前期研究中，已经对这30例配对的结直肠癌与其淋巴结转移癌组织进行免疫组化检测其SNAI1的表达，得出结直肠癌与其淋巴结转移癌组织的SNAI1表达差异无统计学意义［14］。而SNAI1也是发生EMT的细胞获得的标志物之一［15］。

我们还采用Real-time RT-PCR检测结直肠癌细胞系SW480和SW620的E-cadherin和vimentin的mRNA的表达。这两种细胞系来自同一亲本，遗传背景一致，分别具有不同的转移潜能。通过检测发现，SW480与SW620中E-cadherin和vimentin的mRNA表达差异有统计学意义，均以后者为高(P=0.037)。通过HE染色观察这两种细胞的形态，发现SW480和SW620均以伸长的纤维母样细胞和有核仁类圆形细胞为主，两者形态较类似，这符合余力等［16］的研究结果。伸长的细胞形态是EMT细胞的形态特征之一［17］。单从形态上分析，SW480和SW620均具有EMT和非EMT的形态特征，这进一步证实了上述的推测。

通过本研究及结合相关文献报道，我们推测结直肠癌中，发生了EMT的癌细胞获得侵袭、转移能力，使它们能够离开原发灶在远处转移定植，在远处部位定植后，部分癌细胞发生MET，重新获得上皮表型，部分癌细胞仍保留EMT特征，所以原发癌及其淋巴结转移癌的EMT特征差异无统计学意义，而部分癌细胞保留EMT特征可能是更远部位发生转移的原因，但这需要进一步的分子生物学研究实验数据来支持。

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