塞来昔布对人三阴性乳腺癌细胞MDAMB-231迁移、侵袭及黏附性的影响

王玲 单保恩 张建彬

河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室， 河北 石家庄 050011

三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是近些年学者提出的一个新的乳腺癌亚型，该类乳腺癌具有发病年龄早、预后差、极易发生侵袭转移的特点，其中超过70%的病例在明确诊断时已经发生转移，成为死亡的主要原因［1-2］。由于内分泌治疗和针对Her-2的靶向治疗对TNBC无效，至今对TNBC仍缺乏令人满意的综合治疗方案。因此，TNBC的复发和转移是目前治疗TNBC中亟待解决的问题。

塞来昔布(celecoxib)是一种新型非甾体类抗炎药，选择性抑制环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)，而对COX-1没有抑制作用［3-4］。近年来研究发现，塞来昔布具有很好的抗肿瘤活性，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移［5-7］。我们前期的研究资料显示，塞来昔布可以抑制人TNBC细胞MDA-MB-231细胞增殖、诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞［8-9］，但关于塞来昔布是否对MDA-MB-231细胞侵袭行为产生影响目前还不清楚。为此，本研究以体外培养的人TNBC细胞MDA-MB-231为研究对象，观察塞来昔布对MDA-MB-231细胞黏附、迁移以及侵袭能力的影响。评价塞来昔布用于临床TNBC治疗的可能性，为其临床应用提供理论基础和方法学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人TNBC细胞株MDA-MB-231购自中国科学院细胞库上海保藏中心。胎牛血清购自杭州四季青公司。DMEM培养基购自Gibco公司。胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、磷酸盐缓冲液(PBS)购自Sigma公司。塞来昔布购自美国辉瑞有限公司。Matrigel胶购自美国BD Bioscience公司。Transwell侵袭小室购自美国Costar公司。

1.2 细胞培养与实验分组

用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 μg/mL)的DMEM完全培养基，在37 ℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度条件下进行培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态，细胞生长呈70%～80%融合状态时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，隔日换液，每3～4天传代一次。塞来昔布溶解于DMSO，使用前用DMEM完全培养基稀释到所需的浓度，其中DMSO终浓度＜0.1%。实验分为溶剂对照组和药物干预组。以0.1%终浓度的DMSO作为溶剂对照组。药物干预组塞来昔布终浓度分别为0、40、80、120 μmol/L。实验时取对数生长期MDAMB-231细胞，根据不同实验要求收集细胞。

1.3 细胞基质黏附实验

实验时取出预冷好的Matrigel胶，用无血清DMEM培养基将Matrigel稀释成0.04 g/L备用，96孔培养板中每孔2 μg，37 ℃无菌风干过夜。每孔加入适量的无血清DMEM培养基，放置30 min，洗去多余的胶。取经过0、40、80、120 μmol/L塞来昔布处理24 h的MDA-MB-231细胞，以每孔5×104个细胞接种在铺胶的96孔板中，每组设6个复孔的平行对照。置37 ℃、CO2体积分数为5%的温箱中培养2 h后，然后每孔加入MTT 20 μL (5 g/L)继续培养4 h，每孔加入DMSO 150 μL，在振荡器上震荡10 min，然后在酶标仪490 nm波长处读取吸光度值(D)。以对照组细胞D值为参考，计算经塞来昔布处理后细胞相对黏附率。相对黏附率(%)=(D实验组/D对照组)×100%。

1.4 细胞划痕实验

收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，以2×105mL-1接种于24孔培养板中。待细胞长至80%左右融合时，更换无血清的DMEM，培养细胞24 h，用来饥饿细胞。待细胞长到完全融合时，用10 μL加样枪头在每孔单层细胞上划痕，造成培养细胞划痕模型。划痕后用PBS冲洗2遍。沿划痕边缘等距离间隔做上标记，以便检测。实验分组同前，继续培养24 h，定时用倒置显微镜下观察划痕愈合程度并拍照。计算越过0 h划痕边界的细胞数，并与对照组越过划痕的细胞数相比计算百分率，以此反映细胞的平面迁移能力。以上实验至少重复3次。

1.5 Transwell侵袭小室实验

实验采用带有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室，将Matrigel (50 mg/L)胶和无血清DMEM培养基以1∶3比例进行稀释。在小室上室铺100 μL稀释好的Matrigel胶，37 ℃无菌保持过夜，确保Matrigel胶充分聚合。收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，用DMEM培养基调整细胞浓度为2×105mL-1，每孔加入200 μL细胞悬液于上室，用DMEM培养基补充至1 mL。下室加入预先培养MDA-MB-231细胞24 h后的上清液，每孔600 μL。实验分组同前。孵育约24 h后，取出上室。用棉签头擦掉Matrige胶及胶上细胞，PBS液洗3次。24孔板中加入500 μL含5 g/L MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37 ℃、4 h后取出。24孔板中加入500 μL DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10 min，使MTT充分溶解。取出小室，于酶标仪上测D值。以上实验重复3次。

1.6 RT-PCR检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) MMP-2及MMP-9 mRNA表达水平

按1.2实验分组，取对数生长期的MDAMB-231细胞培养24 h后，提取细胞的总RNA，进行RNA完整性及纯度的鉴定。使用反转录试剂盒，合成cDNA。以β-actin 为内参照，β-actin的产物长度为838 bp，扩增β-actin引物序列：上游引物5’-ATCTGGCAC CACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’，下游引物5’-CGTCATCCCTGCTTGCTGATCCA CATCTGC-3’。扩增MMP-2引物序列：上游引物5’-GGATGATGCCTTTGCTCG -3’，下游引物5’-CAGTGGACATGGCGGTCT-3’，预期PCR产物大小为590 bp。扩增MMP-9引物序列：上游引物5’-AACTCACGCGCCAGTAGAAG-3’，下游引物：5’-GAGGTGGACCGGATGTTCC-3’，预期PCR产物大小为105 bp。

β-actin反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，32个循环，72 ℃终延伸5 min，4 ℃终止。MMP-2反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性60 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30个循环，72 ℃终延伸5 min，4 ℃终止。MMP-9反应条件：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环，72 ℃终延伸5 min，4 ℃终止。取5 μL PCR扩增产物，直接加样于1.5%琼脂糖凝胶加样孔中，80 V电压，电泳30 min，用凝胶成像系统分析并拍摄图像，采用Gel-Pro Analyzer 3.1分析软件分析条带灰度值，mRNA表达相对值=目的片段灰度值/β-actin灰度值。

1.7 统计学处理

实验数据用均数±标准差()表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学处理，实验组与对照组比较用t检验，两组以上数据比较用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 塞来昔布对人TNBC细胞MDA-MB-231黏附能力的影响

结果显示，经80、120 μmol/L塞来昔布作用24 h后，MDA-MB-231细胞对细胞外基质的相对黏附率分别为(50.2±7.3)%、(31.5±2.2)%，与未经塞来昔布处理的对照组细胞相对黏附率［(96.8±10.9)%］相比明显减少(P＜0.05)。说明塞来昔布能够显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的黏附力。

2.2 塞来昔布对人TNBC细胞MDA-MB-231迁移能力的影响

划痕实验结果显示，对照组MDA-MB-231细胞24 h后向划痕边缘爬行的速度快，细胞铺展迅速，划痕的宽度明显变窄，有些细胞已经爬行至划痕的中央。而经40、80、120 μmol/L塞来昔布作用后，细胞向划痕边缘爬行的速度明显减慢，划痕缺损处修复缓慢。经统计学处理，80和120 μmol/L实验组越过划痕的细胞数与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05，图1)。提示随着塞来昔布药物浓度的增加，细胞的平面运动能力明显下降。

2.3 塞来昔布对人TNBC细胞MDA-MB-231侵袭能力的影响

Transwell侵袭小室实验结果显示，经过塞来昔布处理后，通过人工基底膜的MDA-MB-231细胞的D值明显降低。80和120 μmol/L塞来昔布作用后透过人工基底膜细胞的D值分别为0.561±0.072、0.318±0.056，与对照组(0.927±0.102)相比，差异具有统计学意义(P＜0.05，图2)。可见塞来昔布对MDAMB-231细胞体外的侵袭力具有很强的抑制作用，且呈剂量依赖性。

2.4 塞来昔布对人TNBC细胞MDA-MB-231 MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响

RT-PCR检测结果显示，经不同浓度(终浓度40、80、120 μmol/L)塞来昔布处理24 h后，MDA-MB-231细胞MMP-2 mRNA的相对表达水平分别为0.32±0.09、0.25±0.06和0.09±0.03，显著低于对照组(0.48±0.12)，差异具有统计学意义(P＜0.05，图3)；MMP-9 mRNA的相对表达水平分别为0.41±0.05、0.28±0.03和0.13±0.02，其中80、120 μmol/L组显著低于对照组(0.47±0.06)，差异具有统计学意义(P＜0.05，图4)。

3 讨 论

TNBC相对于其他类型的乳腺癌亚型而言，具有更高的侵袭和转移特性，给治疗带来了极大的困难，每年都有大量患者因复发或转移而死亡［10-11］。人TNBC细胞MDA-MB-231是一种高侵袭性、分化差、生长倍增速度快的乳腺癌细胞，经常被用来建立人TNBC的裸鼠模型［12］。本实验我们选取该细胞作为研究对象，观察塞来昔布对该细胞体外侵袭转移能力的影响。

目前研究认为，肿瘤的侵袭和转移主要分为三步，细胞与基底膜的黏附、细胞外基质的降解和细胞的迁移［13-14］。因此，细胞与基底膜的黏附是肿瘤发生侵袭的前提和必要条件。本研究塞来昔布能抑制MDA-MB-231细胞的黏附，并呈剂量依赖性。在肿瘤的侵袭与转移的过程中，肿瘤细胞必须穿过血管、淋巴管的基底膜才能进入血管和淋巴管，达到转移的目的。因此，肿瘤细胞受趋化因素趋化并穿过基底膜的能力是侵袭和转移的关键因素之一。我们采用正常培养MDA-MB-231细胞24 h的培养上清液作为趋化因素、Matrigel作为人工基底膜，通过Transwell侵袭小室观察肿瘤细胞侵袭人工基底膜情况。结果显示，用40 μmol/L塞来希布处理细胞24 h，细胞的体外趋化运动能力开始降低，但与对照组相比，差异无统计学意义；而80、120 μmol/L塞来昔布可以显著地抑制细胞体外穿越人工基底膜的能力，减少细胞的趋化运动。肿瘤细胞与母体瘤分离，侵袭周边正常组织时，需要一定的运动能力。划痕实验结果显示经塞来昔布作用后，细胞向划痕中央迁移的速度明显减慢，高剂量组药物显示对细胞迁移能力具有明显抑制作用，并呈剂量-效应依赖性。最新的研究报道，塞来昔布可以抑制胰腺癌、口腔鳞状细胞癌、食管鳞癌等多种肿瘤细胞的侵袭［15-17］。本部分的实验结果也显示，塞来昔布可以显著地抑制人TNBC细胞MDA-MB-231的运动及侵袭能力，提示塞来昔布可能有利于防治TNBC的早期转移。

MMPs是肿瘤细胞侵袭周边正常组织中最为重要的一组蛋白酶。某些因素使MMPs在肿瘤细胞内过表达，当其表达大于其抑制剂TIMPs时，这种平衡发生改变，会导致基质降解，肿瘤易发生浸润和转移［18-19］。多项研究已证实，MMP-2和MMP-9高表达与乳腺癌转移密切相关，在发生早期转移的乳腺癌患者中，这两种蛋白酶的表达增高更为明显［20-22］。本研究发现，塞来昔布可以不同程度地降低MDA-MB-231细胞MMP-2、MMP-9的mRNA表达，从转录水平抑制肿瘤细胞酶的表达作用，防止过量的MMP集聚在细胞周围，阻断肿瘤细胞为其自身转移创造条件。但关于塞来昔布对MMP-2、MMP-9转录后的调节机制，我们还在进一步实验研究中。

本研究的结果表明，塞来昔布可以抑制人TNBC细胞株MDA-MB-231体外黏附、运动和侵袭能力，具有潜在的抑制肿瘤转移的功能；这一功能可能与塞来昔布能降低肿瘤细胞内MMP-2和MMP-9基因的表达有关。以上结果为临床上塞来昔布防治TNBC的转移提供了理论依据。

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