塞来昔布对乳腺癌细胞株的放射增敏作用

牛国梁 王辉 谢荣俊 张树友

南华大学附属南华医院普外科，湖南 衡阳 421002

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，对早期患者实行保乳治疗加放疗已是当今的总趋势。放疗正成为乳腺癌局部和区域治疗的重要手段，但肿瘤细胞本身对放射线的敏感性差、在放疗中存在放射抗拒等因素影响了放疗疗效，且放疗不良反应大。因此，寻找一种高效低毒的放疗增敏剂成为研究的热点。塞来昔布(celecoxib)是环氧化酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)的选择性抑制剂，其具有高效低毒、胃肠道反应小等特点，研究发现塞来昔布不仅能抑制肿瘤的发生、发展，还能提高肿瘤放疗和化疗的敏感性，其确切机制尚不明确［1-2］。研究发现，PI3K/Akt信号通路在肿瘤的放射抵抗性中起重要作用［3］。本实验研究塞来昔布对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞放射敏感性的影响，并探讨塞来昔布是否通过阻断PI3K/Akt信号通路提高其放射敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料及主要试剂

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞由中国科学院上海生物化学与细胞研究所提供；PRMI 1640培养基、胰蛋白酶为美国GIBCO BRL公司产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；塞来昔布为美国辉瑞公司产品；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品；鼠抗人pAkt、Akt单克隆抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体购美国Santa Cruz公司产品；羊抗兔二抗为北京中杉金桥生物公司产品；BCA蛋白定量检测试剂盒为美国Pierce公司产品；ECL发光检测试剂盒为联科公司产品。

1.2 细胞培养

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液，置于37 ℃、饱和湿度、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，培养瓶贴壁面至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代一次，传代后取对数生长期细胞进行实验。

1.3 细胞照射

直线加速器为德国Siemens Primus，6MV X-ray，将直线加速器机架角度为180度，剂量率200 cGy/min，射野大小为10 cm×10 cm，源皮距(source skin distance，SSD)为100 cm，加1.5 cm等效组织(培养瓶倒置于治疗床面，培养瓶的细胞面朝上，并在瓶面上加垫1.5 cm厚等效有机玻璃板)。

1.4 MTT法检测塞来昔布的细胞毒性

取对数生长期细胞(细胞浓度为2×104mL-1)，以每孔200 μL接种于96孔板，于37 ℃，CO2体积分数为5%的培养箱中培养4 h贴壁后，换成含塞来昔布终浓度分别为10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L和60 μmol/L继续培养，对照组为含0.5%DMSO的培养液，每一浓度设4个复孔，培养24 h后，每孔加入MTT 20 μL(以PBS配成5 mg/mL)，继续培养4 h后，每孔加DMSO 150 μL，震荡10 min。在酶联免疫检测仪上490 nm波长测定各孔的光密度值(D值)。以上实验重复3次。按公式：细胞生长抑制率=(1-D实验组/D对照组)×100%。计算药物对MDA-MB-231细胞生长抑制率，并计算塞来昔布IC50和IC20，取IC20作为后续实验浓度。

1.5 克隆形成实验

MTT实验得到塞来昔布IC20值20 μmol/L，即为实验浓度。实验分4组，对照组：含有和其他组相等浓度的DMSO溶解剂；药物组：DMSO溶解的塞来昔布；照射组：X线照射；实验组：塞来昔布联合X线照射。对照组及药物组于细胞贴壁后，分别更换含或不含20 μmol/L塞来昔布培养液继续培养24 h，0.25%胰酶消化，悬浮细胞，台盼蓝检测细胞活性并计数活细胞，按100个细胞/孔，接种于12孔培养板，无药培养液继续培养10 d左右。照射组及实验组于细胞贴壁后，实验组更换含20 μmol/L塞来昔布培养液，继续培养24 h。照射组及实验组分别给予0、2、4、6、8、10 Gy X-ray照射，剂量率为200 cGy/min，照射后，消化、悬浮、计数活细胞，根据不同照射剂量(由低到高)，分别接种100、100、500、500、1 000、1 000个细胞于12孔培养板。无药培养液继续培养10 d左右，甲醇固定，Gimsa染色，低倍倒置显微镜下计数各孔细胞数大于50个的细胞集落数，计算存活分数，绘制剂量效应曲线。克隆率(plating efficiency，PE)=对照组每孔克隆数/每孔细胞种植数×100%，以PE作为校正系数计算存活分数(surviving fraction，SF)，SF=实验组每孔克隆数/(每孔细胞种植数×克隆率)，以单击多靶数学模型拟合细胞存活曲线，计算出照射组和实验组的准域剂量(Dq)、平均致死剂量(D0)、2 Gy照射的存活分数(SF2)值，放射增敏效应以放射增敏比(SERD0)表示，定义为照射组与实验组的D0之比。上述实验重复3次。

1.6 流式细胞分析法(flow cytometry，FCM)检测肿瘤细胞凋亡

按上述实验分组，取对数生长期的MDA-MB-231细胞2×106个消化，悬浮，接种于100 mL培养瓶中，37 ℃，CO2体积分数为5%的培养箱中培养，培养瓶贴壁面至70%～80%融合时，对照组及照射组更换含0.5% DMSO培养液，药物组和实验组更换20 μmol/L塞来昔布培养液，以照射剂量为6 Gy干预后，继续培养24 h，然后收集细胞。75%冰乙醇固定，在4℃固定24 h，去固定液，PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。上述实验重复3次。

1.7 Western blot法检测Akt、pAkt表达

按上述实验分组，对照组及照射组更换含0.5% DMSO培养液，药物组和实验组更换20 μmol/L塞来昔布培养液，以照射剂量为6 Gy干预后，继续培养24 h，收集细胞。裂解细胞提取总蛋白，BCA法蛋白定量，取40 μg蛋白SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移至已用甲醇激活的硝酸纤维素膜(PVDF)上，封闭液震动封闭1 h，分别加入抗pAkt、Akt、β-actin一抗，37 ℃温育1 h，洗膜后加入相应二抗37 ℃温育1 h。暗室中用ECL发光法显色，曝光，显影，定影，水洗。以上实验重复3次。胶片用薄层扫描仪进行灰度扫描，用AlphaImager 2200软件分析各产物的灰度值，将各灰度值与对应标本β-actin对照的灰度值相比，计算出样本蛋白相对表达量。

1.8 统计学处理

实验结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析。所有数据以均数±标准差()表示。多组间数据比较采用方差分析；两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTT实验结果

MTT法检测发现，不同浓度塞来昔布作用MDA-MB-231细胞24 h后，有明显的抑制作用，并且呈剂量依赖性。根据药物效应中效方程式法计算出药物IC50、IC20分别约为(50.14±2.42) μmol/L、(20.21±1.34) μmol/L。选择IC2020 μmol/L作为后续实验浓度。

2.2 克隆形成实验结果

照射组和实验组克隆形成后，计算细胞存活分数并通过单击多靶模型拟合细胞存活曲线(图1)，计算出Dq、D0、SF2值(表1)。可以看出，实验组Dq、D0、SF2明显低于照射组，且放射增敏比SERD0为1.277，表明塞来昔布对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231具明显放射增敏作用。

表 1 照射组和实验组细胞放射生物学参数Tab.1 The radiobiological parameters of the MDA-MB-231 cells after treatment

2.3 FCM检测细胞凋亡结果

与对照组相比，塞来昔布和单纯照射与对照组相比，均能诱导MDA-MB-231细胞凋亡(t=15.49，P＜0.05；t=24.69，P＜0.05)，两者联合作用交单纯照射组的效果更显著(t=14.01，P＜0.05) (图2，表2)，说明塞来昔布能提高MDA-MB-231细胞对放射线的敏感性。

表 2 MDA-MB-231细胞凋亡率的比较Tab.2 Comparison of apoptosis rates in MDA-MB-231cells after treatment

2.4 Western blot法检测Akt、pAkt表达结果

以β-actin为内参照，Western blot法检测蛋白质的表达。结果显示，实验各组Akt蛋白表达没有明显的差异，各组蛋白相对灰度分析差异无统计学意义(P＞0.05)。塞来昔布能抑制pAkt表达，而放射线能提高pAkt表达，两者联合使用后pAkt蛋白表达比单纯照射组降低。各组pAkt蛋白相对灰度分析差异有统计学意义(P＜0.05，图3)。

3 讨 论

环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸生物合成前列腺素(prostaglandin，PG)的限速酶，PG参与机体多种生理及病理过程。COX分为COX-1型和COX-2型。COX-1主要参与体内正常的生理过程。COX-2为诱生表达，在多种恶性肿瘤中高表达，其与肿瘤的发生、发展密切相关［4-5］。塞来昔布是一种高选择性的COX-2抑制剂，它能通过阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞调亡、阻断肿瘤介导的免疫抑制表达、抑制肿瘤新血管生成等起到抗肿瘤作用［6-8］。研究还发现，塞来昔布可增强放射线对肿瘤的作用，但其机制尚未清楚，其可能的机制有：降低细胞内前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)水平，去除放射保护、抑制细胞增殖促进凋亡、阻滞于对放射线敏感的细胞周期［9］、抑制DNA损伤的修复［10］、抗血管生成等［11］。PI3K/Akt信号通路在绝大多数人类肿瘤中表达失调，调节着肿瘤细胞的增殖和凋亡，并且与肿瘤的血管形成和侵袭转移以及对化学耐药、放疗抗拒密切相关［12-13］。但PI3K/Akt信号通路与塞来昔布在肿瘤细胞放射增敏中的作用及机制尚不清楚。

本实验研究塞来昔布对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞放射线的作用，流式细胞仪检测结果显示，塞来昔布能够明显提高肿瘤细胞的放射敏感性。克隆形成实验单击多靶模型是衡量细胞放射敏感性的最广泛的方法。本研究克隆形成实验结果显示，塞来昔布对MDAMB-231细胞有明显的放射增敏作用。塞来昔布联合X线照射组的Dq、D0、SF2较单纯照射组均降低，SERD0为1.277。Dq减小，说明细胞存活曲线肩区缩小，放射抗拒性降低；D0减小，SF2降低，放射抗拒性降低，使细胞亚致死损伤修复能力降低从而达到放射增敏的效果。这可能是塞来昔布降低肿瘤细胞的放射抗拒，提高放射敏感性的重要因素。

肿瘤细胞在受到放射线作用于后，细胞内会发生一系列生物化学反应，以修复其受损的结构和功能，恢复肿瘤细胞的克隆源性增殖能力，甚至增强增殖能力，从而使肿瘤细胞对放射线产生抗拒，抑制肿瘤细胞的凋亡或死亡。而细胞的信号转导通路在这一过程中起了重要的作用。PI3K/Akt信号转通路是一条重要的信号转导通路，其在细胞代谢、细胞周期调控、血管生成等方面发挥重要作用［14-15］。Akt又称蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)是PI3K/Akt信号转导通路的核心，是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)下游最主要的作用靶标，PI3K激活的Akt可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase 9、NF-κB、mTOR、Par-4、P21等，从而诱发肿瘤细胞增殖，促进细胞存活［16］。我们实验发现，实验各组Akt在蛋白表达水平没有明显改变，而塞来昔布组pAkt蛋白明显低于对照组，说明塞来昔布能够抑制Akt磷酸化，这与Barnes等［17］研究的塞来昔布能够抑制COX-2，从而抑制Akt磷酸化一致。而单纯放射组提高pAkt蛋白的表达，推测照射后Akt磷酸化可能是细胞对射线损伤的一个早期反应事件，这也可能是肿瘤细胞放射抗拒的重要原因。塞来昔布联合照射线组pAkt蛋白低于单纯照射组，说明塞来昔布具有抑制放射线诱导Akt磷酸化的作用，增强了放射敏感性。

我们的研究提示，放射线可诱导MDAMB-231细胞PI3K/Akt信号转导通路的活化，提高肿瘤细胞的放射抗拒，塞来昔布则能够抑制PI3K/Akt信号转导通路的活化，从而提高了乳腺癌放射敏感性。

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