结直肠癌原发及转移灶中PI3K、p-Akt及mTOR的表达及意义

肖秀英 于宝华 王丽莎 倪淑娟 杨晓燕 朱玉芬

1.上海市徐汇区中心医院肿瘤科，上海 200031；

2.复旦大学附属肿瘤医院病理科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

近年来，随着人们生活水平的提高及生活习惯的改变，结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势。肿瘤的浸润与转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，也是结直肠癌患者死亡的主要原因。作为细胞生长、增殖和抗凋亡的重要调节通路——PI3K/Akt信号转导在结直肠癌转移中的作用仍未完全阐明［1］。本研究采用免疫组化EnVison法同时检测结直肠癌原发灶及其相应转移灶组织中PI3K、p-Akt及mTOR的表达，探讨它们在结直肠癌转移中的作用及其潜在的临床应用价值。

1 资料和方法

1.1 资料

收集上海市徐汇区中心医院2007—2008年手术切除的结直肠癌原发灶及相应的转移灶标本各60例，均经病理证实为腺癌，术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗。其中，男性33例，女性27例；年龄24～78岁，中位年龄52岁；发病部位结肠26例，直肠34例；肝转移灶2例，淋巴结转移病灶58例。根据WHO肿瘤组织学分类，高分化腺癌4例，中分化腺癌34例，低分化腺癌22例。另选10例癌旁正常结肠黏膜组织作对照。

1.2 组织标本的制备

将结直肠癌原发灶和转移灶组织蜡块标本收齐后制备成厚5μm连续切片，每块组织的连续切片中，均取一张做HE染色对照。

1.3 免疫组化检测

采用EnVision两步法，操作步骤严格按照说明书进行。PI3K(p110α)、p-Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)购于Cell Signal公司，均为兔抗人浓缩型单克隆抗体，工作浓度依次为1∶100、1∶50、1∶50。EnVision试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术开发公司。用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。切片脱蜡入水后，于95 ℃～98 ℃柠檬酸盐缓冲液(pH为6.0±0.1)中水浴修复15 min，自然冷却至室温(约25℃)。擦干切片周围水分，3% H2O2室温温育10 min，TBS冲洗3次，每次5 min，加入一抗工作液4 ℃过夜，TBS漂洗3次，每次5 min，加入HRP标记的二抗，37 ℃下温育45 min，TBS漂洗3次，每次5 min，DAB室温下显色，镜下控制反应时间，充分冲洗中止反应。苏木精复染胞核，染色1 min，1%盐酸乙醇分色3 s，脱水透明、封片。

1.4 结果判断

［2］方法观察PI3K蛋白的分布和阳性率。PI3K和p-Akt均为细胞质内表达，mTOR在细胞核及细胞质中均表达，镜下观察肿瘤细胞膜或细胞质出现棕黄色或褐色颗粒，染色明显高于背景为阳性。阳性判读标准：染色定位于细胞膜及细胞质均为阳性，未见阳性肿瘤细胞者为0分，阳性肿瘤细胞数＜10%者为1分，阳性肿瘤细胞数≥10%者为2分。0分和1分均视为阴性，2分视为阳性。

1.5 统计学处理

采用χ2检验和四格表的精确概率法，用统计软件SPSS 11.5对各指标表达结果进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结直肠癌原发及转移灶组织中PI3K的表达

PI3K蛋白主要定位于细胞质，镜下癌细胞胞质内出现棕黄色颗粒，同一患者原发及转移灶表达见图1A、B。本组60例结直肠癌原发及转移灶组织中，PI3K阳性率分别为30.0%(18/60)和46.7%(28/60)；转移灶阳性率高于原发灶，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)，表明结直肠癌癌细胞转移后PI3K表达能力增加(表1)。

2.2 结直肠癌原发及转移灶组织中p-Akt的表达

p-Akt主要定位于细胞质，癌细胞胞质内出现棕黄色颗粒(图2A、B)。60例结直肠癌原发及转移灶组织中，p-Akt的阳性率分别为53.3%(32/60)和50.0%(30/60)，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)，表明结直肠癌转移前后癌细胞p-Akt的表达无变化(表1)。10例癌旁正常黏膜阳性率为20.0%(2/10)。

2.3 结直肠癌原发灶及转移灶组织中mTOR表达

mTOR主要定位于细胞质，癌细胞胞质内出现棕黄色颗粒(图3A、B)。60例结直肠癌原发及转移灶组织中，mTOR的阳性率分别为41.7%(25/60)和55.0%(33/60)，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)，表明结直肠癌转移后癌细胞mTOR的表达增强(表1)。此外，本组结直肠癌组织中PI3K和mTOR的表达与其分化程度、患者年龄、性别、发生部位均无关(P＞0.05)。

3 讨 论

PI3K是一类特异性磷酸化肌醇磷脂3位羟基的激酶，称为PI3Ks家族。依据PI3Ks结构和底物的特异性不同，将PI3Ks分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型［3］。Ⅰ型又可分ⅠA和ⅠB两个亚型，受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)活化ⅠA型PI3Ks，G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)活化ⅠB型PI3Ks。其中Ⅰ型PI3Ks是由催化亚基p110和调节亚基p85构成的异二聚体，在肿瘤的发生、发展中起重要作用［4］。活化的PI3K可使磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇4-磷酸(PI-4-P)、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphate idylinositol-4，5-bisphosphate，PI-4，5-P2)肌醇环的第3位发生磷酸化，产生磷酸化磷酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphate idylinositol-3，4，5-trisphosphate，PI-3，4，5-P3)［5］。目前认为PI-3，4-P2和PI-3，4，5-P3是细胞内新型的第二信使，与胞质内含有血小板-白细胞C激酶同源(pleckstrin homology，PH)区的信号分子结合后发挥活性调节作用。在本组60例结直肠癌原发及转移灶组织中， PI3K阳性率分别为30.0%(18/60)和46.7%(28/60)；转移灶阳性率高于原发灶，两组差异有统计学意义(P＜0.05)，表明结直肠癌癌细胞转移后PI3K表达能力增加，提示PI3K与结直肠癌的发生、发展有关，其机制可能是通过促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡来实现。有研究表明，抑制PI3K活性可促进加工caspase-3的蛋白酶活化或增加caspase-3对该蛋白酶的敏感性， 因此PI3K可能通过抑制caspase-3活化来发挥抗凋亡作用［6］。

Akt即蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一种相对分子质量为57×103的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、PI3K的下游分子，与致小鼠白血病的病毒癌基因v-Akt高度同源，故名Akt。因其激酶活性区的氨基酸序列与蛋白激酶A和蛋白激酶C高度相似，故称PKB。通过PH区和PIP3结合，通过磷脂酰肌醇依赖性激酶1，2(PDK1、PDK2)使其第308位上的苏氨酸位点(Thr308)和第473位上的丝氨酸位点(Ser473)磷酸化而被激活［7］。目前主要认为Akt介导体内PI3K依赖的细胞黏附、运动、侵袭和转移效应。本研究发现，Akt的表达在结直肠癌原发灶及转移灶中无差别，提示Akt在结直肠癌的转移过程中变化不明显，可能是结直肠发生过程中的早期事件。随后我们检测了10例癌旁正常黏膜Akt的表达情况，结果阳性率为20.0%，表明Akt可能在结直肠癌的发生早期发挥重要作用，这与以往研究结果一致［8］。近来也有学者报道，应用免疫组化的方法发现在结直肠癌中Akt阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜，与本报道结果一致［9］。但汤建民等［10］报道，在非小细胞肺癌组织中磷酸化Akt表达增加，与肿瘤组织分化程度、临床分期以及有无淋巴结和远处转移相关。因此，结直肠癌组织中Akt的表达与肿瘤是否转移存在确切关系，可能需要扩大样本量进一步深入研究。

表 1 结直肠癌原发及转移灶组织中PI3K、p-Akt、mTOR的表达Tab.1 Expression of PI3K, p-Akt and mTOR in colorectal carcinoma and its metastasis spots

雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)是1991年被发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是Akt下游的一个重要靶基因，属于PIKKS家族(包括DNA-PK、ATM、ATR和MG-1)。由于其羧基末端与PI3K催化区高度同源，被认为是PI3K相关的蛋白激酶家族成员。在哺乳动物中存在序列保守的TOR基因，称之为mTOR。活化的PI3K/Akt通过TSC1/2复合物进一步激活其下游分子mTOR。mTOR能够磷酸化它的2个下游分子，即翻译抑制分子eIF4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein，4EBP1)和核糖体蛋白p70S6K(ribosomal70S 6 kinase，RSK)［11］。4EBP1磷酸化后失活，降低了与eIF4E的结合能力，解除了eIF4E和4EBP1之间的相互作用，使eIF4E与之分离，并与其他翻译起始因子结合，从而启动蛋白质的翻译。而pS6K磷酸化后激活其功能，增加了cyclinD1、CDK4、CDC25A和Rb磷酸化的表达，促进蛋白质的合成［12］。在本研究60例结直肠癌原发及转移灶组织中，mTOR的阳性率分别为41.7%(25/60)和55.0%(33/60)，两组差异有统计学意义(P＜0.05)，表明结直肠癌转移后癌细胞mTOR的表达增强。这与项洪刚等［13］研究的结直肠癌组织中mTOR的阳性率42.2%相一致。

总之，PI3K和mTOR在结直肠癌组织高表达，且在转移灶的阳性率较原发灶高，将有助于加深对结直肠癌发生、发展机制的理解，为结直肠癌的基因治疗和药物治疗提供了一定的分子生物学依据。

［参 考 文 献］

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