小鼠肾集合管发育中的细胞凋亡与水通道蛋白2的表达

田鹤，王旭，李晓明，郭敏

（1.辽宁医学院组织学与胚胎学教研室，辽宁 锦州 121001；2.辽宁中医药大学组织学与胚胎学教研室，沈阳 110032）

机体从胚胎到发育成熟不仅经历细胞增殖的过程，同时也伴随着细胞凋亡。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，在胚胎器官发育中起着重要作用［1］。在细胞凋亡过程中，多种基因家族及其产物起着关键性的作用。研究报道，水的转运在细胞凋亡过程中发挥一定的作用，在集合管中水的转运主要是通过水通道蛋白 2（aquaporin-2，AQP-2）来完成的［2］。为了进一步探讨AQP-2与细胞凋亡及集合管发育的关系，本研究通过免疫组织化学、体视学、电镜和TUNEL染色法观察小鼠肾集合管发育过程中AQP-2的表达和细胞凋亡情况，探讨两者的关系及在肾集合管发育过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和光、电镜标本制备

昆明小鼠，按雌雄比例1∶1同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间，以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄（embryonic，E）0 d。记录受孕时间，然后将孕鼠分笼饲养，每日早8：00和晚5：00观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后日龄（neonatal，N）0 d，记录出生日期。选取 E16、17、18 d 的胎鼠和 N1、3、7、14、21、40 d 的仔鼠，每组取5只鼠。将孕鼠用乙醚麻醉后剖腹取胎鼠，E16，E17，E18 d 的胎鼠剖腹取肾，N1，N3，N7，N14，N21，N40 d仔鼠处死后取肾。左肾入10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片，厚5μm，用作免疫组化和TUNEL染色。右肾以2.5﹪戊二醛固定，仔鼠肾脏的髓质、胚胎全肾进行树脂包埋，取树脂包埋块，LKB-V型超薄切片机先切半薄切片，经光镜观察选择后进行超薄切片，厚度为50~70 nm。醋酸铀、枸橼酸铅染色，1200EX（JEOL）透射电镜观察。

1.2 免疫组织化学方法检测AQP-2（SABC法）

石蜡切片脱蜡后，经微波修复10 min后滴加3%H2O2室温孵育10 min，滴加山羊血清封闭液室温孵育 5 min，加一抗（浓度 1∶100）37℃孵育 1 h，滴加生物素标记的二抗37℃孵育30 min，滴加SABC 37℃孵育30 min，DAB显色5 min，苏木精复染、脱水、透明、封片，光镜下观察。用PBS代替一抗作阴性对照。抗体稀释均用pH7.4的PBS。

1.3 检测细胞凋亡（TUNEL法）

石蜡切片脱蜡后，滴加蛋白酶K（20 mg/L溶于三羟甲基氨基甲烷/盐酸中）室温孵育15 min，滴加TUNEL混合溶液（50μL/片），37℃孵育 60 min，滴加转化剂 POD（50μL/片），37℃孵育 30 min，DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封片，光镜下观察。用不含末端脱氧核苷酸转移酶的液体代替TUNEL混合溶液作阴性对照。

1.4 体视学测量

用SABC法染色的切片每个动物的肾随机取5张，切片在油镜下按“S”形选取视野，采用方格测试系统，交点计数法测算AQP-2在集合管管腔膜阳性表达的面密度值，公式为：Sv=2Ll=2 Ix/Lc（Lc=ΣPc·a），式中Ix为阳性表达的细胞膜与测试方格的交点数，Pc为落在参照系的测试点数，a为方格的两点间距离，相当于实际长度的0.1 mm。用TUNEL法染色的切片每个动物的肾随机取5张，切片在400倍光镜下按“S”形选取视野，采用方格测试系统，至少计数1 000个细胞，计算阳性细胞所占的百分比。细胞凋亡指数=凋亡阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5 统计学处理

数据以x±s表示，采用单因素方差分析。统计分析用SPSS16.0软件完成，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TUNEL染色结果

细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞。N1 d小鼠的集合管上皮中可见阳性细胞（图1），N7 d时阳性细胞数最多（图2）。N14 d开始，阳性细胞数量逐渐减少。

图1 N1 d小鼠肾集合管，可见少量凋亡细胞 TUNEL染色×1 000Fig.1 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N1 d TUNELstaining×1 000

图2 N7 d小鼠肾集合管，可见大量凋亡细胞 TUNEL染色×1 000Fig.2 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N7 d TUNELstaining×1 000

2.2 电镜观察结果（图3，4）

图3 N7 d小鼠肾集合管中的凋亡细胞 电镜×6 500Fig.3 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N7 d Electron microscope×6 500

图4 N7 d小鼠肾集合管中的凋亡细胞 电镜×10 000Fig.4 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N7 d Electron microscope×10 000

N1 d即可见到凋亡细胞，N7 d的集合管中凋亡细胞明显，凋亡细胞的主要表现为细胞体积缩小，核固缩，染色质凝聚成球形、半月状、月牙状。

2.3 免疫组织化学染色结果

免疫组织化学染色显示，E17 d小鼠肾中出现集合管，此时可见AQP-2微弱表达，表达部位为集合管的管腔膜和胞质内，呈棕褐色（图5）。随后，在E18 d以及N1，3，7 d的集合管管腔膜和胞质内均有阳性表达的AQP-2，表达强度逐渐增强（图6）。N14 d至N40 d的集合管中均可见阳性表达的AQP-2，但是表达强度无明显变化。

图5 E17 d小鼠肾集合管，AQP-2弱表达 免疫组化×1 000Fig.5 The expression of AQP-2 in collecting ducts was faint at E17 d Immunohistochemistry staining×1 000

图6 N7 d小鼠肾集合管，AQP-2强表达 免疫组化×650Fig.6 The expression of AQP-2 in collecting ducts was strong at N7 d Immunohistochemistry staining×650

2.4 体视学测量

对TUNEL染色阳性的细胞进行凋亡指数测量，结果显示N1 d，集合管中细胞凋亡指数为（32.46±3.69）%，到N7 d达到高峰，细胞凋亡指数为（45.36±4.35）%，以后随着日龄增加凋亡细胞逐渐减少。面密度值测量结果显示，AQP-2从E17 d的胎鼠开始表达，至N7 d其表达量达最高峰，N7 d至N40 d，AQP-2的面密度值与前一时间点测量值比较无统计学差异（表1）。

表1 小鼠肾集合管不同发育阶段细胞凋亡指数以及AQP-2在集合管表达的面密度值（x±s）Tab.1 The apoptosis index and surface area density of AQP-2 in the collecting ducts during development（x±s）

3 讨论

细胞凋亡是机体为了维持内环境的稳定，由基因控制的一种自主有序的生理性死亡［3］。在组织、器官的发育过程中，细胞凋亡具有控制细胞数量，消除多余、衰老、异常细胞的作用［4］。凋亡的形态学特征之一是水的流失和细胞体积缩小，细胞体积的缩小会改变细胞内外的渗透梯度，使水通过单纯扩散和借助水通道蛋白（如AQP-2）流出细胞，继之启动细胞凋亡过程［5，6］。

TUNEL是目前比较常用的探讨细胞凋亡的形态学手段，本研究结果显示，在N1 d的小鼠肾集合管中可见TUNEL阳性细胞，N7 d阳性细胞染色最强，凋亡指数最高，N7 d至N40 d凋亡细胞数量逐渐减少。这表明集合管在N1 d至N7 d是发育的主要阶段，虽然细胞数量已够，但是集合管需要通过细胞凋亡来不断清除因增生而过剩的细胞，以利于管腔的形成及调控自身的发育速度。N7 d至N40 d，生长和成熟是集合管的主要特点，此期的集合管不再分支，进入发育完善时期［7］。为了鉴别TUNEL阳性细胞是否由于细胞自身分裂形成，本研究应用电镜技术观察了集合管中的细胞凋亡现象，结果与TUNEL染色一致。本研究结果显示AQP-2在E17 d时开始出现表达，部位是集合管主细胞的管腔膜和细胞胞质内，至N7 d表达强度最强，随后表达强度无明显改变。对在主细胞管腔膜表达的AQP-2进行的面密度值测量显示AQP-2表达的面密度值在N7 d达到最大值，之后无明显变化。这些结果提示在集合管发育过程中，细胞凋亡与AQP-2有一定的相关性。Ma等［8］发现过度表达AQP-2促进细胞体积的缩小和凋亡过程的启动。Jablonski等［9］也证实在细胞凋亡过程中，过度表达的AQP-2失去活性，丧失对水的转运能力，使细胞内的离子环境有利于激活caspase等内切酶，进而启动细胞凋亡，证实了AQP-2与细胞凋亡关系密切，与前人的结果相一致［10，11］。本研究认为N1 d至N7 d是集合管快速发育的时期，此期集合管的细胞数量已足够其生长需要，为了适应自身的形态变化及有利于管腔的形成，需要以凋亡的形式来清除过剩的细胞。AQP-2的表达与此过程一致，即N1 d表达较强，至N7d达到最高峰，因此，我们推测小鼠肾集合管N1 d至N7 d快速发育期的细胞凋亡是由AQP-2介导的，AQP-2影响集合管的发育过程，关于此过程的分子机制还有待于进一步研究。

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