碳酸酐酶Ⅰ、Ⅱ在结直肠癌中的表达及意义

王宁，陈洋，姜奕

（中国医科大学附属第一医院1.普通外科；2.中心实验室，沈阳 110001）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道肿瘤，目前认为其发生、发展经历从正常上皮—增生—腺瘤—癌—浸润转移这样一个过程［1，2］。碳酸酐酶（carbonic anhydrases，CA）是一组催化H++HCO3-葑H2O+CO2可逆反应的同工酶。CA家族包括十几个成员，其中 CAⅠ、CAⅡ位于细胞质内［3，4］。迄今为止关于CAⅠ、CAⅡ在CRC中表达情况的报道不多，它们的表达与CRC的发生、发展以及临床病理特征的关系尚有待进一步阐明。本研究采用免疫组织化学法，对CAⅠ、CAⅡ在正常结直肠黏膜、息肉、腺癌及转移淋巴结中的表达进行研究，探讨CAⅠ、CAⅡ的表达与结直肠癌的发生、发展以及临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

取自中国医科大学附属第一医院普通外科2008年3月至2010年9月术前未经放化疗、手术切除的64例原发性CRC患者标本，患者平均年龄（61.4±12.5）岁，其中男33例，女31例。术后病理证实64例均为腺癌。术后病理证实的20个转移淋巴结（lymph node metastasis，LNM）来自 15例腺癌，27个息肉（包括增生性息肉17个和腺瘤性息肉10个）来自上述15例腺癌同时切除的标本。另外3个腺瘤为结肠镜无法电切，经手术切除并经术后病理证实。55个配对的正常黏膜取自CRC患者，距肿瘤10 cm以上肉眼观察正常处。CRC中高分化18例，中分化33例，低分化13例；TNM分期Ⅰ期4例，Ⅱ期31例，Ⅲ期25例，Ⅳ期4例。

CAⅠ羊抗人多克隆抗体、CAⅡ鼠抗人单克隆抗体购自Santa Cruz公司（PBS稀释，浓度为1∶100）。三步法免疫组织化学试剂盒购自福州迈新公司。

1.2 方法

对以上组织进行甲醛固定，石蜡包埋，连续切片。其中1张切片行HE染色供病理诊断，其余切片供免疫组织化学研究。

石蜡切片以二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化。新鲜配制的3%双氧水，室温15 min去除内源性过氧化酶。用蒸馏水和pH 7.4的PBS缓冲液清洗后，高温高压修复：置于pH 6.0的柠檬酸缓冲液入高压锅中加热至沸腾2 min，PBS缓冲液冲洗。滴加动物非免疫血清，室温封闭1 h，滴加一抗，4℃孵育过夜。用PBS冲洗后，滴加生物素标记的二抗，室温下反应20 min。再用PBS冲洗。滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温下反应20 min，PBS冲洗，DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染或轻染。自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察，依信号的强弱分为阴性（-）0分，弱阳性（+）1分，中度阳性（++）2分，强阳性（+++）3分。

1.3 统计学处理

利用SPSS统计软件，计量资料以x±s表示，采用秩和检验进行统计学分析，对有配对标本者进行配对秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

CAⅠ、CAⅡ于胞质内着色，正常黏膜主要着色区位于肠腔侧的腺细胞，而癌组织则无此特点。CAⅠ、CAⅡ信号在正常黏膜中最强，在增生和腺瘤性息肉减弱，CRC 中最弱（图 1，2）。

图1 CAⅠ在正常黏膜、腺瘤、腺癌及转移的淋巴结中表达 ×200Fig.1 The expression of CAⅠ in normal mucosa，adenoma，cancer and LNM（Stained with diaminobenzidine and counterstained with hematoxylin，×200）

图2 CAⅡ在正常黏膜、腺瘤、腺癌及转移的淋巴结中表达 ×200Fig.2 The expression of CAⅡ in normal mucosa，adenoma，cancer and LNM （Stained with diaminobenzidine and counterstained with hematoxylin，×200）

CAⅠ强度在配对的正常黏膜、癌组织中分别为（2.95±0.23）和（1.64±0.52），二者差异有统计学意义（P＜0.01）。CAⅠ在增生性息肉和腺瘤性息肉中分别为（2.39±0.50）和（2.44±0.53），与配对的正常黏膜比较显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。CAⅠ在CRC中强度与匹配的息肉（2.41±0.50）比较显著降低（P＜0.01）。然而，CAⅠ在配对的CRC和LNM 中表达强度相近，分别为（1.86±0.36）和（1.67±0.58），差异无统计学意义（P=0.10）。高、中、低分化的 CRC 中 CAⅠ表达分别为（1.84±0.50）和（1.63±0.50）、（1.57±0.51），虽逐渐降低但差异无统计学意义（P=0.21）。在CRC的Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期中CAⅠ表达分别为（1.63±0.56）、（1.76±0.44），二者差异无统计学意义（P=0.33）。

CAⅡ表达在配对的正常黏膜、癌组织中分别为（2.80±0.49）和（1.20±0.87），二者差异有统计学意义（P＜0.01）。CAⅡ表达在增生性息肉和腺瘤性息肉中分别为（2.59±0.51）、（2.50±0.53），与配对的正常黏膜比较显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），而增生性息肉与腺瘤性息肉间CAⅡ表达差异无统计学意义（P=0.66）。CAⅡ在CRC中表达与匹配的息肉（2.56±0.51）比较显著降低（P＜0.01）。然而，CAⅡ表达在配对的CRC和LNM（1.35±0.67）中强度相近，差异无统计学意义（P=0.61）。高、中、低分化的CRC 中 CAⅠ表达分别为（1.34±0.91）、（1.17±0.90）、（0.96±0.63），虽逐渐降低但差异无统计学意义（P=0.60）。在CRC的Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期中CAⅠ表达分别为（1.32±0.80）、（0.98±0.87），差异无统计学意义（P=0.91）。

3 讨论

CA是一组含锌的金属酶，负责催化H++HCO3-葑H2O+CO2可逆反应，以实现对酸碱平衡等的调节。据报道CAⅡ是CA家族中活性最高的，而CAⅠ的活性则为中等［3~5］。

由于CO2很容易被动弥散通过细胞膜，因此细胞质内的CAⅠ、CAⅡ在正常情况下主要是使反应向右进行，从而帮助CO2的跨膜转运［4，6］。虽然肿瘤细胞外呈酸性（pH 5.6~6.8），但细胞内却呈中性或碱性（pH 7.2~7.5）［3，7，8］。而 HCO3-是体内维持碱性环境的重要物质。因此，我们推测肿瘤细胞为了减少HCO3-的丢失，CAⅠ、CAⅡ表达降低。而来自糖酵解产生的乳酸等的H+则通过Na+/H+交换等主动排出细胞外［4，9］。

Kummola等认为，CAⅠ、CAⅡ基因均位于8号染色体q臂上，而且密切关联。调控区域或等位基因的缺失或点突变可导致CAⅠ、CAⅡ的表达同时降低。并推测CAⅠ、CAⅡ可能发挥着抑癌功能［5］。

CAⅠ、CAⅡ在正常黏膜中的表达主要在临近肠腔侧，而且无论在正常结直肠黏膜组织中还是CRC中CAⅠ、CAⅡ表达高低与在结直肠中不同部位无关，与文献报道相符［10］。CAⅠ、CAⅡ在正常黏膜中表达最强，在良性息肉、癌组织中逐级降低［10］。由于本组CRC中Ⅰ期和Ⅳ期仅各有4例，故我们将Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期分2组比较，并证实CAⅠ、CAⅡ在CRC中表达与分期无关。Kivela等也认为CAⅠ、CAⅡ在CRC中表达与Dukes分期无关［10］。但Bekku等用Western blot法研究证实CAⅠ、CAⅡ在CRC中的表达随Dukes分期的进展显著降低［11］。与Kivela等的结果不同［10］，本研究显示虽然随着分化程度的降低，CAⅠ、CAⅡ强度减弱，但差异无统计学意义。Bekku等［11］的研究表明CAⅠ的表达与CRC分化无关；但CAⅡ在结肠癌中，中分化低于高分化（P＜0.04），在直肠癌中的表达与分化无关。而Nieme等对77个遗传性非息肉病性CRC的研究表明CAⅡ的表达与分化程度和Dukes分期均无关［12］。

近年关于CRC的比较蛋白质组学研究也显示，CAⅠ、CAⅡ是CRC组织中表达显著下调中的两个蛋白［13~16］。而且将CAⅡcDNA克隆转染CRC细胞后，癌细胞侵袭、趋化运动能力及耐药性均明显降低［13，14］。

本研究与Kivela等的结果相符，在淋巴结转移中CAⅠ、CAⅡ的表达不再继续降低，甚至略高于原发灶［10］。白雪等的研究也表明，与原发灶比较，肝转移灶中CAⅡ的表达并未显著降低［14］。

综上所述，CAⅠ、CAⅡ是正常结直肠黏膜腺上皮细胞中所必需的酶。CAⅠ、CAⅡ的表达从增生性息肉和腺瘤开始即显著低于正常黏膜，说明CAⅠ、CAⅡ表达下调是CRC发生中的早期事件。CAⅠ、CAⅡ在LNM中表达与原发灶相比无显著差异，说明CAⅠ、CAⅡ表达下调与LNM无关。

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