microRNA-24对人喉鳞癌Hep2细胞增殖及侵袭的影响

郭艳，尚超，孙开来，钟鸣，富伟能

（中国医科大学1.口腔医学院中心实验室，沈阳 110002；2.基础医学院医学遗传学教研室，沈阳 110001）

喉癌是原发于上皮的最常见的头颈部恶性肿瘤，其中绝大多数组织类型是鳞状细胞癌（laryngeal squamouscell carcinoma，LSCC）。尽管科研工作者从多个层面致力于喉鳞癌的研究，但其生存率和治疗策略一直没有显著的提高。近年来，微小RNA（microRNAs，miRNAs）的发现为肿瘤治疗靶点的研究带来了新的曙光，它是一类长约22个核苷酸的非编码小RNA，通过降解靶基因mRNA或抑制其翻译而在肿瘤的发生、发展过程中发挥着类似于癌基因和抑癌基因的功能［1］。Li等［2］应用 miRNAs芯片建立LSCCmiRNAs表达谱，发现微小RNA-24（microRNA-24，miR-24）表达水平显著低于癌旁组织，且与淋巴结转移相关，提示miR-24在LSCC发生、发展中可能发挥着抑癌基因的功能。因此，本研究中我们将以LSCCHep2细胞系为研究对象，体外生物合成miR-24前体（pre-miR-24），通过转染、MTT 和 Transwell小室法进一步探讨miR-24对LSCC细胞增殖、侵袭能力的影响，以期为miR-24介导的LSCC分子机制研究乃至LSCC有效分子靶标的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人LSCCHep2细胞系和鼠NIH3T3细胞系由本室保存，常规培养于RPMI 1640培养基（Gibco）中，取对数生长期的细胞用于后继实验。

1.2 miR-24前体合成与细胞转染

miRNA-24前体（pre-miR-24）由 Ambion公司合成，cotrol miR为阴性对照。Hep2细胞于转染前24 h接种于 24孔板中（4×104/孔），按照脂质体 LipofectamineTM2000操作说明将50 nmol/L pre-miR-24和control miR分别转入Hep2细胞中，单独转染脂质体组为空白对照。37℃5%CO2培养箱中重新培养后进行相关检测。

1.3 荧光定量PCR检测转染效果

用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion）提取总miRNA。QuantiMir反转录试剂盒（System Biosciences）逆转录成小RNA的cDNA。根据操作说明应用SYBR荧光染料（Ambion）检测pre-miR-24的表达，U6-snRNA为内参。miR-24特异性上游引物为：5′-TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG-3′，通用下游引物为：5′-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACATGGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCT CGGATCCACTAGTCC（T）25VN-3′。反应体系为 30 μL，反应条件为：95 ℃ 10 min，然后按 95 ℃ 15 s，60℃1 min进行40个循环。应用的仪器是ABI公司的7500荧光定量PCR仪，使用的软件是7500 Software V2.0.5。3次独立样本经过3次独立实验后得到的数据通过比较 CT 值法（2－ΔΔCT）进行相对定量分析。

1.4 相差显微镜下观察细胞生长情况

Pre-miR-24转染Hep2细胞36 h后，分别在相差显微镜下观察各组细胞的生长情况并拍摄照片。

1.5 细胞增殖检测

Hep2细胞转染pre-miR-24及其对照control miR 1、3、5、7 d 后，细胞增殖检测同参考文献［3］。

1.6 体外细胞侵袭能力检测

［3］。

1.7 统计学分析

所有实验重复3次，应用SPSS13.0统计分析软件对实验数据进行t检验，结果表示为x±s，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光定量PCR验证转染效果

为了确定pre-miR-24是否已经成功导入Hep2细胞中，我们在转染36 h后，用荧光定量PCR相对定量的方法检测了miR-24的表达情况，结果发现，转染36 h时，pre-miR-24转染组中miR-24的表达较对照组明显升高（图1A、1B），该结果表明瞬时转染成功，后继实验可以采用pre-miR-24转染36 h的细胞进行分析。

图1 荧光定量PCR检测miR-24表达结果。Fig.1 Result of miR-24 expression assayed by real-time quantitative PCR

2.2 miR-24抑制LSCCHep2细胞增殖

为了了解miR-24在LSCC Hep2细胞中的作用，我们在Hep2细胞中转染pre-miR-24 36 h后，通过相差显微镜观察pre-miR-24对Hep2细胞形态的影响，结果发现转染pre-miR-24组Hep2细胞明显变圆、细胞数量明显减少（图2A-2C），提示pre-miR-24能抑制Hep2细胞的生长；同样MTT实验表明，与转染control组相比，pre-miR-24转染组Hep2细胞增殖能力显著降低（图2D），进一步证实了miR-24具有抑制Hep2细胞增殖的能力。

2.3 miR-24降低LSCCHep2细胞体外侵袭能力

Hep2细胞转染pre-miR-24 36h后，通过Transwell小室侵袭实验观察各组细胞侵袭能力的变化，结果显示pre-miR-24转染组的跨膜细胞数为（12.37±0.52），明显低于control miR转染组和空白对照组的跨膜细胞数［（32.48±0.95）；（34±1.25）］，差异有统计学意义（P<0.05），提示miR-24具有抑制Hep2细胞侵袭的作用。

图2 miR-24对Hep2细胞增殖能力的影响Fig.2 Effects of miR-24 on Hep2 cell proliferation

3 讨论

miRNAs是一种广泛存在的对基因表达进行转录后水平调控的分子，具有控制基因表达及细胞增殖、分化和凋亡等多种功能，几乎在所有肿瘤的发生或发展过程中均可检测到miRNAs的过表达或表达缺失，而且这些异常表达的miRNAs通常超过半数定位于癌基因或抑癌基因的相关遗传区域，从而表现出类似癌基因或抑癌基因的作用［4，5］。研究表明，miR-24定位于染色体的EST区域，且该区域为染色体上的不稳定区域，在头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中经常发生改变［6］。

关于miR-24异常表达与肿瘤生物学行为的关系目前仍然存在争议。有的学者认为miR-24在肿瘤的发生、发展中发挥着类似于肿瘤抑制基因的功能，而有的学者认为miR-24发挥着癌基因的作用。如在宫颈癌Hela细胞中，miR-24表达下调，细胞增殖能力明显增强；在肺癌A549细胞中，miR-24表达下调导致细胞生长水平的下调［7］。尽管2种观点存在矛盾之处，但2者一致性认为miR-24在肿瘤中发挥重要的功能，并且目前尚没有关于miR-24与LSCC发生、发展及生物学功能的研究。本研究发现，通过体外人为的上调miR-24的表达能明显改变Hep2细胞形态，使细胞数量明显减少，细胞的增殖和侵袭能力明显降低，证实miR-24能够减慢LSCC的发展速度，抑制LSCC的细胞增殖和侵袭能力。另外，由于miRNAs在血液中稳定性很好，而且轻微的miRNAs表达降低即可在患者外周血中检测到很高水平的miRNAs表达变化［8］，并且血液标本的采集损伤性小，进一步揭示血液中miR-24的表达变化亦可能成为临床上极具价值的非侵入性LSCC诊断材料之一。

但为什么miR-24在不同组织类型中的表达不一样，并且发挥的作用也不尽相同，甚至完全相反呢？我们推测这一现象的主要原因在于不同类型细胞中的miR-24调控的靶基因存在差异，导致参与的细胞信号转导通路差异，进而对细胞生长、增殖等生物学活性产生不同的调控效应。因此，在未来的研究中，我们将分析LSCC中miR-24的靶基因，进一步探讨miR-24抑制细胞增殖和侵袭的分子机制。

参考文献：

［1］Farazi TA，Spitzer JI，Morozov P，et al.miRNAsin human cancer［J］.JPathol，2011，223（2）：102-115.

［2］Li L，Zhang ZM，Liu Y，et al.DNA microarrays-based microRNA expression profiles derived from formalin-fixed paraffin-embedded tissue blocks of squammous cell carcinoma of larynx ［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2010，39（6）：391-395.

［3］郭艳，富伟能，尚超，等.HLA-B对喉癌Hep2细胞生物学行为的影响［J］.山东医药，2011，51（11）：21-22，33.

［4］Lal A，Navarro F，Maher CA，et al.miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2，MYC，and other cell-cycle genes via binding to"seedless"3′UTRmicroRNA recognition elements［J］.Mol Cell，2009，35（5）：610-625.

［5］Sevignani C，Calin GA，Nnadi SC，et al.MicroRNA genes are frequently located near mouse cancer susceptibility loci ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（19）：8017-8022.

［6］Yu YH，Kuo HK，Chang KW.Theevolvingtranscriptome of head and neck squamous cell carcinoma：a systematic review ［J］.PLoSOne，2008，3（9）：e3215.

［7］Cheng AM，Byrom MW，Shelton J，et al.Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis ［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（4）：1290-1297.

［8］Lin SC，Liu CJ，Lin JA，et al.miR-24 up-regulation in oral carcinoma：positive association from clinical and in vitro analysis ［J］.Oral Oncol，2010，46（3）：204-208.