ERK1/2在AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡中的表达及意义

单海燕，白小涓，李效丽

（中国医科大学第一附属医院老年心血管科，沈阳 110001）

血管内皮功能受损是动脉粥样硬化早期事件的始动环节，该损伤很可能是细胞凋亡增高所致［1，2］。细胞凋亡的信号转导通路研究是凋亡研究最关键的领域之一［3］，因此本研究旨在观察血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）诱导的内皮细胞中凋亡调控基因Bcl-2、Bax mRNA及细胞外信号调节激酶1/2（extracellar signal-regulated protein kinase，ERK1/2）在不同时点的表达变化，揭示血管内皮细胞凋亡的分子调控机制，从而为延缓内皮细胞凋亡、防治动脉粥样硬化开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基、胰蛋白酶﹑HEPES、L-谷氨酰胺（Gibco公司，美国），人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）（ATCC，美国），AngⅡ、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）﹑Hochest33258（Sigma公司，美国），兔抗人Bcl-2、Bax单克隆抗体非免疫血清、兔抗人ERK1/2单克隆抗体非免疫血清、生物素二抗、辣根酶标记的链霉亲和素（HRP-Streptaridin）试剂（Santa Cruz公司，美国），流式细胞仪 FACScan（BD 公司，美国），荧光显微镜（Olympus公司，日本），Biophotometer分光光度仪（Eppendort公司，德国），GeneAmpPCR System9700扩增仪（PE公司，美国），UVP凝胶成像及分析系统（UVP公司，英国）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC培养：使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养HUVEC贴壁生长，置于5%CO2、37℃、完全饱和湿度的培养箱中，每2~3 d换液1次。用0.25%胰蛋白酶进行消化﹑传代。2%台盼蓝染色判断细胞活性，活细胞数占细胞总数98%以上者用于实验。

1.2.2 四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法测定细胞活性：将细胞接种于每孔含100μL培养液的96孔培养板中（1×104/孔），培养过夜；弃培养液，对照组（6孔）每孔加入100μL培养液，实验组（6孔/组）加入含不同浓度（10-8﹑10-7﹑10-6﹑10-5﹑10-4mol/L）AngⅡ的100μL 培养液，培养 24 h；加入 MTT 10μL/孔，培养4 h；弃培养液，加入DMSO 150μL/孔，振荡摇匀，使结晶充分溶解；酶联免疫检测仪在570 nm下测定各孔光吸收值，以实验组与对照组光吸收值的百分比代表存活细胞的百分数。

1.2.3 内皮细胞凋亡形态学观察：细胞长至亚融合后，无血清同步6 h，加入AngⅡ（终浓度为10-6mol/L），持续刺激24 h。将细胞分为对照组（不含AngⅡ的培养液培养24 h）和AngⅡ组（含AngⅡ的培养液培养24 h）。收集细胞，常规涂片固定，Hoechst33258染色后封片。荧光显微镜观察，照相。镜下随机选取6个视野，计数凋亡细胞和总细胞数，计算凋亡百分率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 内皮细胞凋亡定量：收集1×106个细胞，1 000 r/min离心，PBS洗2次，重悬细胞于200μL的1×结合缓冲液，加入10μLAnnexin V-FITC和5μL PI混匀，室温避光15 min。加入300μL 1×结合缓冲液，1 h内流式细胞仪检测早期凋亡细胞数，用Cell Quest软件分析结果。

1.2.5 Bcl-2、Bax细胞免疫化学染色：将细胞接种于6孔培养板中的洁净盖玻片上，分组干预后，PBS洗细胞，采用SP法进行免疫组化染色，DAB显色，常规脱水、透明、封固。在200倍的光镜视野下观察到胞质或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞，计数每个高倍视野中100个细胞中Bcl-2、Bax阳性细胞个数，每张切片中采集5个视野并求均值，得出阳性细胞百分率及Bcl-2/Bax值（BB值）［4］。

1.2.6 Western blot检测ERK1/2蛋白水平：收集细胞，冷PBS洗2次，加入预冷细胞裂解液，超声破碎，冰上孵育提取物30 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液至新试管中，再离心1次，取上清分装，-20℃保存待用。考马斯亮蓝法测蛋白浓度。参照文献［13］进行Western blot，蛋白电泳分离胶浓度为 12%（pH8.8），浓缩胶浓度 4%（pH6.8），抽提纯化的蛋白（每个样品20μL）行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉的TBST 4℃封闭过夜，加入兔抗人ERK1/2一抗（1︰100）室温孵育3 h，TBST洗涤，加入二抗室温孵育0.5 h，洗膜，化学发光试剂显色。AlphaImager图像处理系统进行定量分析，设对照组显影带灰度值为1，各不同时间组与其灰度值之比即为该组的相对活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞存活率

MTT法检测结果示，培养HUVEC 24 h后，10-7mol/L与10-8mol/L AngⅡ组细胞存活率与对照组相比无统计学差异，10-6mol/L组存活细胞数降至对照组的（87.6±0.09）% （P<0.01），10-5mol/L 和 10-4mol/L组存活细胞数降至（45.6±0.08）%（P<0.01）。本实验选用10-6mol/L的AngⅡ建立了HUVEC的凋亡模型。

2.2 凋亡HUVECs的细胞核形态学变化

Hochest33258荧光染色显示，正常HUVEC细胞核边界整齐，染色质分布均匀，呈现体积较大的浅染核形态（图1A）；AngⅡ诱导HUVEC则表现为细胞核呈浓染致密颗粒状、块状荧光，出现不同程度的核固缩，呈现体积明显缩小的深染核形态（图1B）。

2.3 AngⅡ对细胞凋亡率的影响

图1 正常组与AngⅡ诱导组HUVECs的形态学变化Hoechst33258染色×400Fig.1 HUVECs stained with Hoechst33258×400

流式细胞仪检测结果表明，AngⅡ诱导HUVEC平均凋亡率为（37.4±1.6）%，较正常对照组［（10.2±1.8）%］显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），但2组间的细胞坏死率无统计学差异。

2.4 AngⅡ作用时间对Bcl-2、Bax表达的影响

细胞免疫化学染色法结果显示，HUVEC在AngⅡ作用下，12 h时Bcl-2表达开始减少，随着时间的延长其表达呈递减趋势，24 h时减少41.9%（P<0.01）；而Bax的表达则于12 h时开始增加，随着时间的延长呈递增趋势，24 h增加68.2% （P<0.01）；Bcl-2/Bax比值于12 h时开始呈明显下降趋势（P均<0.01）。见表 1。

表1 各组HUVECs的Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax的比较Tab.1 Expression of Bcl-2，Bax protein in immunocytochemistry staining and Bcl-2/Bax of HUVEC in each group

2.5 AngⅡ对ERK1/2表达的影响

Western blot结果显示，随着AngⅡ作用时间的延长，HUVEC内ERK蛋白质磷酸化水平逐渐升高，12 h时达对照组的1.42倍（P<0.05），18 h时ERK蛋白磷酸化水平达高峰，为对照组的3.68倍（P<0.01），之后逐渐下降，但仍高于对照组，24 h时磷酸化水平为对照组的1.79倍（P<0.05）。2组内皮细胞中总ERK1/2蛋白表达差异无统计学意义。见图2。

图2 各组HUVECs ERK1/2蛋白表达的Western blot结果Fig.2 Western blot analysis of ERK1/2 protein expressions of HUVECs in each group

3 讨论

细胞外对外界刺激的调节反应是通过细胞内信号转导通路对信号的快速传递来实现的。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导通路是生物体内重要的信号转导系统之一［5，6］，其中 ERK1/2 信号转导通路属于 MAPK 家族［7，8］，它在炎性细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。大量研究证实，当各种因素（如压力负荷、肾上腺素、AngⅡ等）激活后，ERK1/2将信号从细胞外传递至细胞内，并发生磷酸化，迅速穿过核膜作用于下游的信号分子［9~11］，引起特定蛋白的表达或活性改变，从而参与细胞的基因表达、迁移、分化、凋亡和增殖调控作用［6，8，12］。本研究发现，AngⅡ能显著增加 HUVEC 内ERK1/2磷酸化，提示AngⅡ可激活HUVEC的pERK1/2通路，但该途径通过哪些蛋白发挥凋亡作用尚未知。

凋亡相关基因Bcl-2能够抑制细胞凋亡，Bax基因是Bcl-2家族的一员，其产物是一种与Bcl-2同源的相关蛋白，能够拮抗后者的生物学活性［13］。Bax的主要作用是加速细胞凋亡，并与Bcl-2一起调节细胞凋亡。Bax不仅能和Bcl-2形成异源二聚体抑制凋亡，而且其自身还能形成同源二聚体诱导凋亡［9，13，14］。研究表明，Bcl-2 及 Bax 二者间的比例对于细胞、组织的影响较绝对量更为重要，是决定细胞凋亡与否的关键因素。Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡蛋白和Bax、Bad等促进凋亡的蛋白的相对比率决定了细胞多种凋亡刺激信号的最终敏感性和抵抗性。本研究结果发现，随着AngⅡ诱导HUVEC时间的延长，Bcl-2表达水平下降，Bcl-2/Bax比值显著降低，同时还发现Bcl-2降低与p-ERK1/2表达增加呈相关性，且Bcl-2/Bax比值与p-ERK1/2表达呈相反趋势，提示p-ERK1/2与Bcl-2之间可能存在相互调节关系。由此我们推测在AngⅡ诱导HUVEC的早、中期（6、12 h）显著激活了ERK1/2信号转导通路，且ERK1/2的表达随诱导时间延长，于12 h时明显上升，18 h达高峰，24 h下降至稳定，表明随着AngⅡ持续作用于血管内皮细胞时间延长，其对已发生表型改变HUVEC中ERK信号通路的激活作用已开始增强，同时研究进一步显示，磷酸化ERK1/2表达呈持续增加时，Bcl-2及Bcl-2/Bax比值呈显著下降趋势，表明ERK1/2信号途径可能通过调控Bcl-2/Bax参与HUVEC凋亡。虽然发现ERK1/2可作为上游信号参与调节Bcl-2，但是p-ERK如何调节Bcl-2目前尚不清楚，其作用环节仍有待进一步研究。

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