牛病毒性腹泻病毒基因2型代表株全基因组序列分析

林燕清，朱礼倩，陶 洁，孙宏进，孟祥升，王建业，朱国强

(扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009)

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是牛病的主要病原，能引起腹泻、呼吸道症候群、母畜流产、死胎和畸胎、免疫耐受以及先天性缺陷等[1-3]。BVDV分为基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)。BVDV-1进一步分为11种亚型(BVDV1a-j 10种亚型和鹿群亚型)；BVDV-2分为2个～4个基因群[4-5]。BVDV-2急性感染主要引起出血综合症(HS)，特征为白细胞减少、发热、腹泻、血小板减少、出血和死亡。20世纪80年代，我国李佑民首次分离出BVDV[6]，2003年出现第一株猪源BVDV ZM-95的全基因组序列的报道[7]。

我国对BVDV分离株基因型的鉴定，很少从分子水平上进行，因此本研究将3株BVDV分离株XJ-04、SD-09和QH-09进行全基因组序列测序分析及基因分型，为我国牛病毒性腹泻病(BVD)的分子流行病学研究积累数据，为BVD的预防和控制提供依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株和细胞 BVDV-2型XJ-04株由本实验室分离并鉴定[8,11-12]；(BVDV-2)SD-09株和QH-09株由本实验室分离保存(未发表)；Madin-Darby bovine kidney(MDBK)细胞系由美国宾夕法尼亚大学Dr.Bello惠赠；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

1.2 主要试剂 RNAiso Plus总RNA提取试剂盒和pMD19-T Simple载体均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司；DNA连接酶及其试剂盒购自NEB公司。

1.3 病毒RNA的提取 参照文献[8]和[12]的方法经MDBK培养和传代，按RNAiso Plus试剂盒的说明书提取病毒总RNA。

1.4 引物设计 应用DNAStar软件对GenBank中登录的 BVDV-2全基因组序列：890(U18059)、NewYork93(AF502399)、p11Q(AY149215)、C413(AF002227)、1373(AF145967)和 P24515(AY149216)进行比对，在BVDV保守区内，采用PrimerPremier 5.0软件设计引物(表1)，扩增片段分别以A～Q表示，引物由上海基康生物技术有限公司合成。

表1 BVDV-2全基因组扩增的引物Table 1 Primers used for the amplification of isolates genomic fragments

1.5 全基因组序列的RT-PCR检测 常规方法合成内侧片段A～Q的cDNA，并分别以其为模板进行PCR，反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 1 min、52℃ 1 min、72℃ 50 s，30个循环；72℃ 10 min。按照文献[9]和[10]的方法，在T4 RNA连接酶的作用下，将cDNA的5'与3'末端相互连接。常规方法提取DNA，并进行RT-PCR扩增。

1.6 PCR产物的克隆与测序分析 将回收的PCR产物与pMD19-T载体连接，筛选阳性重组质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。应用DNAStar软件对各片段的测序结果进行拼接，同时将拼接的XJ-04、SD-09、QH-09序列与GenBank登录的瘟病毒科代表病毒株序列，进行同源性比对及结构蛋白糖基化位点的分析。各序列为，BVDV-1株 ： Nose(AB019670)、Oregon C24V(M96751)、SD-1(AF091605)、NADL(M31182)、SingerArg(DQ088995)、ILLNC(U86599)、Osloss(M96687)和ZM-95(AF526381)； BVDV-2 株 ： 890(U18059)、NewYork'93(AF502399)、XJ-04(FJ527854)、KZ-91-CP(U94914)； CSFV 株 ： 94.4/IL/94/TWN(AY646427)、sp01(FJ265020)、Shimen HVRI(AY775178)和 JL1(06)(EU497410)； BDV 株 ： BD31(U70263)、X818(AF037405)；Pestivirusofgiraffe 株：H138(AF144617)。

2 结果

2.1 全基因组序列的RT-PCR扩增 RT-PCR扩增3株分离株各片段，结果表明这3株分离株的18个PCR扩增基因片段均大小相等，且均与预期片段大小相符(图 1)。

2.2 全基因组序列测定结果及同源性分析 对3株分离株XJ-04、SD-09和QH-09的基因组分段测序结果进行拼接，结果表明，3株BVDV-2代表株的全基因组长均为12284 nt，包含5'-UTR、3'-UTR和一个 ORF(编码 3897个氨基酸)。将其中一株BVDV-2(XJ-04株)的全基因组测序结果录入Gen-Bank中，登录号为FJ527854。

基于已获取的全基因组序列和5'-UTR(129 bp～371 bp)，对XJ-04、SD-09和 QH-09进行分型。将测序结果与瘟病毒科各代表病毒株进行比较。分子进化树分析表明，XJ-04、SD-09、QH-09与BVDV-2中890、NewYork93两株的亲源关系比较近，属于BVDV-2基因型(图2)。同时，分别将XJ-04、SD-09和QH-09的自我裂解酶(Npro)与890和NADL的Npro在核苷酸和氨基酸水平分别进行同源性比较分析，结果表明，在核苷酸和氨基酸水平上，这3株BVDV-2株的Npro同源性均与BVDV-2代表株890的同源性最高(87.8%和98.4%)，并高于BVDV-1代表株 NADL(67.1%和 94.8%)。XJ-04、SD-09、QH-09 Npro基因的同源性比较与其全基因的同源性比较结果相一致。

从结构蛋白水平上，将XJ-04、SD-09和QH-09株分别与890和NADL进行同源性比较，结果表明：在核苷酸水平上，XJ-04、SD-09和QH-09株的结构蛋白与890的同源性为90.4%～92.8%，明显高于NADL(64.9%～80.2%)，但两者在氨基酸水平上同源性均很高，分别为97.2%～99.3%和88.3%～96.9%(表 2)。

表2 XJ-04、SD-09、QH-09株结构蛋白的核苷酸和氨基酸与参考株890、NADL同源性比较分析Table1 2 Nucleotide and amino acid sequence identify(%)of isolates XJ-04,SD-09,QH-09 in comparison with reference strains 890 and NADL

根据5'-UTR区域243 bp进行分子进化树分析表明，XJ-04、SD-09、QH-09与 890、NewYork 93和KZ-91-CP同属于BVDV-2a亚型(图3)。

2.3 结构蛋白的糖基化位点分析 3株BVDV-2分离株的ORF均编码3897个氨基酸的单一多聚蛋白，分子量为438.3 ku。氨基酸比对分析表明，点突变主要发生在结构蛋白(Erns、E1、E2)上。通过NetNGlyc1.0软件分析，预测这3株BVDV-2分离株的多聚蛋白均含有20个潜在且完全一致的N-糖基化位点(特征为Asn-X-Ser或Asn-X-Thr)，其中14个位于结构蛋白(Erns、E1、E2)上。同时与890和SD-1进行比较，结果表明，XJ-04、SD-09和QH-09株的结构蛋白除了在Erns第272位氨基酸上不存在糖基化位点，在E1的第516位氨基酸和E2的第951位氨基酸位置上分别各多了一个糖基化位点外，其它均含有相同的糖基化位点(表3)。

表3 XJ-04、SD-09、QH-09株结构蛋白Erns、E1、E2上潜在的N-糖基化位点与890、SD-1的比较Table1 3 Potential N-linked glycosylation sites in structural proteins Erns,E1 and E2 among reference strains SD-1,890 and isolate XJ-04,SD-09,QH-09

3 讨论

本研究采用片段重叠的RT-PCR方法获得3株BVDV-2代表株的全基因组序列。XJ-04、SD-09和QH-09株全长均为12284 bp，无大片段插入或缺失，与瘟病毒科各代表病毒株构建分子进化树进行比较分析，结果表明：XJ-04、SD-09和QH-09株与890、NewYork93株的亲源关系最近，属于BVDV-2。目前我国对BVDV-2的报道较少[8,11-12]，基于本实验对BVDV-2分离株的研究数据，我国流行的BVDV-2有可能来源于北美洲。

依据5'-UTR、Npro、E2和NS2/3基因信息进行BVDV亚基因分型的方法已有报道，本研究同时对Npro核苷酸和氨基酸的同源性进行比较，结果表明，XJ-04、SD-09和QH-09的Npro核苷酸及氨基酸的同源性与BVDV-2代表株890的同源性分别为87.5%～87.8%和98.2%～98.4%，高于BVDV-1代表株NADL。这一结果与XJ-04、SD-09、QH-09全基因与890和NADL的同源性比较结果一致，进一步证实了XJ-04、SD-09和QH-09株均属于BVDV-2。

在结构蛋白上，将XJ-04、SD-09和QH-09株分别与890和NADL进行核苷酸和氨基酸的同源性比对，结果表明XJ-04、SD-09和QH-09株结构蛋白的核苷酸与890的同源性为90.4%～92.8%，明显高于NADL(64.9%～80.2%)，但是氨基酸同源性较高，分别为97.2%～99.3%和88.3%～96.9%，体现了密码子简并性和氨基酸利用的多样性，为E2蛋白体外表达提供了依据。同时，该结果表明这3株BVDV-2分离株的囊膜糖蛋白E2与890有较高的同源性，鉴于囊膜糖蛋白E2的主要免疫原特性，BVDV-1疫苗可能针对BVDV-2感染的有效保护作用不强，应当在疫苗的研制和运用上采用针对性防范措施。

我国BVDV分离与鉴定未能从分子水平上对BVDV分离株进行基因亚型的明确定义，本研究根据5'-UTR中的243 bp，将XJ-04、SD-09、QH-09株与BVDV-1型病毒株中Nose、Oregon C24V、SD-1、Singer Arg、NADL、ZM-95、ILLNC 和 OSLOSS；BVDV-2型病毒株中 890、NewYork 93、Soldan、34B和 KZ-91-CP；Pestivirus giraffe型 H138；BDV毒株 X818和 BD31；CSFV毒株 Sp01、94.4/IL/94/TWN、Shimen HVRI和JL1(06)进行比较，分子进化树分析表明，XJ-04、SD-09和 QH-09与 890、NewYork93和KZ-91-CP株的亲源关系最近，属于BVDV-2a型。我们也可从欧洲多个国家及分离得到的BVDV-1株，并进行系统进化树分析，表明在不同地区流行不同的BVDV-1亚基因型。通过基因分型，我们能较好地阐明某种病毒不同病毒株间的遗传衍化关系。也可以进一步分析BVDV系统发生关系，为瘟病毒的进化、分类、构建反向遗传系统和研究瘟病毒致病分子机制及分子流行病学调查和防控提供依据。

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