H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定

佘利旋，熊永忠，远立国，袁天梅，贾 坤，李守军*

(1.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069；3.海珠区爱宠动物诊疗所，广东 广州 510220)

犬流感(Canine influenza，CI)是由正粘病毒科流感病毒属A型CI病毒(CIV)引起的犬呼吸道传染病。患犬主要临床症状为发烧、咳嗽、流鼻液、食欲减退、精神沉郁等。我国于2006年～2007年从犬体内分离到禽源H3N2亚型CIV[1]；2009年我国报道犬感染H1N1亚型流感病毒，基因序列分析表明该病毒与当时人群中流行的甲型H1N1流感病毒同源性高达99%[2]。国外研究也证实H3N8、H5N1以及H3N2亚型流感病毒可跨越品种障碍而感染犬，H3N8、H3N2亚型CIV还可在犬群中水平传播[3-5]。虽然尚未证实犬在人类流感病毒新亚型演变过程中的作用，但在宠物犬中检测到甲型H1N1流感病毒，足以引起研究人员的重视。

为了解广州地区CI的流行情况，本研究对患有呼吸道症状的犬群进行病原学调查，分离获得CIV，并对其理化特性和生物学特性进行研究，为CI的诊断奠定基础，同时也为广州地区CI疫情监测及科学防制提供依据。

1 材料和方法

1.1 病料样品与血清 2009年2月～12月期间，在广州6家宠物医院临床门诊中，采集107例呼吸道疾病患犬的鼻咽拭子样品和58份恢复期犬血清样品。鼻咽拭子浸于含有青、链霉素的灭菌生理盐水中，用于实验室检测，血清置-20℃保存备用；流感病毒H1、H3和H5标准阳性血清由华南农业大学禽病实验室提供。

1.2 主要试剂 TRIzol®Reagent购自 Invitrogen公司；Reverse Transcriptase XL(AMV)反转录酶、dNTPs、ExTaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、pMD-18T载体、T4 DNA连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；胶回收(小量)试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；E.coliDH5α购自天根生化科技有限公司。

1.3 引物设计与合成 应用DNAStar及Primer Premier软件，对GenBank登录的多个H3N2亚型CIV基因序列进行比较，并在相对保守区分别设计11对扩增8个基因片段的引物，其中PA、PB1和PB2分两段设计。引物由上海英骏生物工程公司合成。

1.4 病毒分离 鼻咽拭子按常规方法处理，经尿囊腔接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，每个拭子接种3枚鸡胚，0.1 mL/枚。37℃孵育，弃去24 h内死亡胚，每12 h观察一次，并将死胚置于4℃冰箱保存。96 h后将存活鸡胚置4℃冷却过夜，无菌收集鸡胚尿囊液。参照国标方法(农业部，2004)进行红细胞凝集(HA)试验。有血凝活性者做进一步鉴定；无血凝活性者将其尿囊液盲传三代，仍无血凝活性者弃去。

1.5 RT-PCR检测 对有血凝活性的尿囊液，按照TRIzol®Reagent使用说明书提取病毒RNA，进行RT-PCR检测，产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 PCR产物的克隆及鉴定 回收目的片段，与pMD18-T载体连接后转化E.coliDH5α细胞内，经菌液PCR筛选阳性克隆，并由上海英骏生物技术有限公司测序。

1.7 序列分析 将测序获得的各病毒株基因序列，录入NCBI BLAST SERVER(Version 2.0)联机检索，对所得的序列进行同源序列比对，并通过DNAStar软件构建HA和NA基因的进化树。本研究选用参考病毒株HA基因的GenBank登录号分别为：DQ124190.1、DQ124196.1、DQ146419.1、CY006013.1、AB289341.1、EU301213.1、EU492530.1、AY862607.1、EU301240.1、GU122024.1和EU127500.2。选用参考病毒株的NA基因的GenBank登录号为DQ124151.1、DQ146420.1、AY862644.1、AY862641.1、AF156395.1、AB276116.1、AB472018.1、EU980503.1、CY005620.1、GU122065.1和 EU127501.2。

1.8 凝集抑制(HI)试验 将血清用受体破坏酶(RDE)处理后，参照国标方法进行HI试验(农业部，2004)。

1.9 理化特性检测 参照文献[6]方法进行乙醚、氯仿的敏感性试验和分离株耐酸性、耐热性试验。1.10 生物学特性检测 参照文献[7-8]方法测定分离株的红细胞凝集谱(牛、猪、公鸡和豚鼠)、鸡胚半数感染量(EID50)、鸡胚死亡平均时间(MDT)和病毒血凝素的稳定性。将病毒反复冻融3次，测定其HA效价，以检测反复冻融对病毒热稳定性的影响。

2 结果

2.1 病毒的分离鉴定 在107份鼻咽拭子样品中，3份样品的鸡胚尿囊液对1%公鸡红细胞有血凝活性，HA效价分别为25、26和25。对鸡胚尿囊液进行流感病毒M基因的RT-PCR扩增，经电泳检测可见大小约1000 bp的条带，与预期(1027 bp)相符(图1)。相对应的3份血清能够被H3亚型CIV阳性血清抑制，因此鉴定3个分离株均为CIV。根据流感病毒通用命名法则，分别命名为A/canine/Guangdong/01/2009(H3N2)、A/canine/Guangdong/02/2009(H3N2)和A/canine/Guangdong/03/2009(H3N2)；缩写为 CGD1、CGD2和 CGD3。

2.2 序列分析 采用设计的11对引物，经RT-PCR扩增、克隆，分别获得3个分离株的cDNA序列(CGD1株各基因的RT-PCR扩增结果见图2)，除HA、NA和NS基因外，其余基因均为高度保守。序列BLAST结果显示：3个分离株的HA和NA基因核苷酸序列分别与GenBank中H3和N2亚型的流感病毒株有较高的同源性。将分离株与代表性流感病毒HA和NA基因核苷酸序列对比，建立H3N2亚型CIV HA和NA基因核苷酸序列系统进化树(图3)，可见分离株的HA和NA基因均与韩国2007年～2008年分离的H3N2亚型CIV属于同一个分支，相似性较高，亲缘关系较近。

2.3 理化特性检测 3个分离株经乙醚、氯仿和酸处理后接种鸡胚，测得尿囊液的HA效价均为0，表明分离株对乙醚、氯仿和酸均敏感。此外，分离株尿囊液经水浴处理后接种鸡胚，50℃水浴60 min后病毒丧失感染力。

2.4 生物学特性检测 3个分离株对公鸡、豚鼠、猪和牛的1%红细胞均具有凝集特性；将分离株分别作10-1～10-5稀释后测定EID50，按Reed-Muench方法计算得到其EID50值分别为10-2.5/0.1 mL、10-3.5/0.1 mL和10-2.42/0.1 mL；将分离株分别做10-2稀释后接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，9 d后对照组全部健活，感染组鸡胚均死亡，死亡鸡胚的尿囊液均对1%公鸡红细胞具有血凝活性；分离株CGD1、CGD2和CGD3的MDT值分别为182.4 h、177.6 h和192 h；分离株分别置56℃水浴15 min，血凝价均下降2个滴度；60 min后病毒均丧失血凝价，表明3个分离株均为热不稳定型。此外，分离株反复冻融3次后血凝效价均下降3个滴度。

3 讨论

样品采集的时间与部位是分离CIV的前提。患犬在临床症状出现前的2 d～3 d开始排毒，一般持续一周左右。故鼻咽拭子样品的采集时间不能晚于症状开始后的3 d～4 d。另外，采样时操作必须迅速，特别是在夏季，应尽快将样本置冰盒内送往实验室或冷藏地点，这也是病毒分离成功与否的关键[9]。Beeler Emily也证实了这一点，认为鼻咽拭子是检测CIV的最佳样品，尤其是在临床症状出现之前所采集的拭子[10]。

本研究分离得到3个CIV分离株，经HI试验、序列测定和分析证实均为H3N2亚型，基因核苷酸序列系统进化树分析表明：3个分离株的HA、NA与禽源流感病毒的HA、NA基因亲缘关系较近，属于同一个进化分支，具有禽源流感病毒HA、NA基因的分子特征，与2006年～2007年我国广东地区分离的4株禽源H3N2亚型流感病毒结果一致。因此，推测广东地区的CIV为禽源H3N2亚型。ChulSeung Lee等通过病原学检测和血清学监测证实2007年韩国犬群中流行的CIV为禽源H3N2亚型[11]。

2009年2月～12月期间，广州地区临床疑似病例中CIV病原学调查的阳性率为2.8%，血清学调查阳性率为6.9%。3个分离株的血凝素均为热不稳定型，病毒在自然条件下存活能力较差，这可能是未引起大范围流行的原因之一[6]。2009年我国报道的犬感染H1N1亚型流感病毒可能仅是个例，但也应引起我们的重视。由于流行病学样本含量不足和采集地区的限制，本研究结果仅反应了广州地区犬群流感的发病情况，如果需要全面掌握我国CI的流行情况，应扩大样本含量和采集范围。

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