应用DNA芯片技术筛选禽致病性大肠杆菌和尿道致病性大肠杆菌的差异表达基因

宦海霞，张 科，陈 祥，高 崧*，刘秀梵

(1.淮阴师范学院生命科学学院，江苏 淮安 223300；2.扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏 扬州 225009；3.淮安出入境检验检疫局，江苏 淮安 223300)

禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)可引起家禽呼吸道感染(气囊炎和肺炎)、心包炎、肝周炎和败血症等局部或全身性感染，给养禽业造成严重的经济损失。APEC和尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli，UPEC)均能够引起广泛流行的肠道外疾病，这与其毒力特性有关。已知的毒力因子包括血清型、黏附素、铁获得系统、毒素、保护素和侵袭素等，这些毒力因子使它们能够在宿主环境中生存进而造成宿主发病[1-5]。因此，UPEC和APEC可能在适应肠道外的生活方式上有相似之处，并体现在毒力基因的组成和表达上。

本研究利用基因芯片技术对APEC E058株毒力基因在鸡体内、外不同培养条件下进行差异表达检测，同时对E058与UPEC HEC4株在LB和人尿液中培养条件下的差异表达基因进行检测，探讨毒力基因、潜在毒力基因在E058菌株中的表达差异，为寻找APEC新的致病基因和探索APEC与UPEC相关性提供依据。

1 材料和方法

1.1 菌株及实验动物 APEC E058株(O2血清型)由本实验室分离、鉴定并保存[6-7]；人UPEC分离株HEC4由扬州市第一人民医院奚群英医生惠赠；实验鸡由山东家禽所购进SPF种蛋孵化获得。

1.2 主要试剂、芯片及仪器 采自25岁～30岁的2个月内未服用抗生素类药物的健康妇女的尿液，经过滤除菌后用于细菌培养；DNA Marker、Taq酶和Klenow酶购自TaKaRa公司；PCR试剂盒和dNTP购自Promega公司；Cy5-dCTP(红色)和Cy3-dCTP(绿色)均购自Amersham公司；9 mer Random Primer购自上海英骏生物技术有限公司；M-MLV反转录酶购自Invitrogen公司；NucleoSpin RNA clean-up试剂盒购自MACHEREY-NAGE公司；LuxScan 10KA双通道激光扫描仪为北京博奥生物有限公司产品。

检测芯片由扬州大学和博奥生物有限公司共同构建[8]，包括154个探针，其中74个为已知大肠杆菌毒力基因、17个耐药基因、6个看家基因以及57个APEC特异性基因[9-10]。

1.3 细菌的培养 将细菌E058株和HEC4株分别接种于LB液体培养基和人尿液中，37℃静置培养至对数生长期(OD600nm值为0.4～0.8)。

1.4 鸡血液中细菌的分离和富集 将APEC E058株于左胸气囊接种1日龄SPF鸡3只(108cfu/只)，5 h后采血，500 r/min离心5 min，上清液室温12000 r/min离心2 min，沉淀于液氮中速冻10 min，-75℃保存。

1.5 总RNA的提取 将细菌培养至对数生长期，室温 12000 r/min离心2 min，无菌水重悬，室温12000 r/min离心2 min，去上清，以TES液裂解菌体，常规酚/氯仿法提取总RNA。

1.6 反转录、标记和杂交 以总RNA为模板，9mer Random Primer为引物，并加入系统外标(对照组x外标1 μL，试验组y外标1 μL)，进行反转录，反转录条件为65℃ 5 min；25℃ 10 min，37℃90 min。反转录终止液65℃作用10 min后，加入10 N乙酸终止反应。反转录产物用PCR NucleoSpin Extract II Kit纯化。

将纯化的反转录产物与9mer Random Primer 95℃变性3 min，进行Klenow酶标记。以Cy3-dCTP标记试验组cDNA，Cy5-dCTP标记对照组cDNA。反应条件为：37℃90 min；70℃5 min；冰浴5 min。标记产物用PCR NucleoSpin Extract II Kit纯化。

标记的cDNA溶于灭菌水中(溶解顺序为先实验组，再对照组)，加入甲酰胺和4×杂交缓冲液，进行杂交，反应条件为：95℃3 min，冰浴5 min。将杂交液点于芯片上，42℃水浴过夜；42℃用含0.2%SDS和2×SSC的洗液以及0.2×SSC溶液中室温分别洗涤5 min。玻片甩干后即可用于扫描。

1.7 芯片扫描及数据分析 采用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪对芯片进行扫描，LuxScan 3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，数据用Lowess方法进行归一化，以t检验结合两倍差异的标准来确定差异表达基因。筛选差异表达基因标准为：(1)统计意义：在95%显著性水平上为显著差异；(2)生物学意义：差异表达大于两倍。

2 结果

2.1 细菌RNA的提取 分光光度计定量提取的细菌总RNA，甲醛变性胶电泳质检显示样品电泳条带清晰，23S与16S rRNA条带亮度比接近或大于1∶1，质量符合实验要求，可以进行芯片试验。

2.2 芯片的杂交结果

2.2.1 E058株芯片扫描图和差异基因 E058株在LB中培养和在鸡体内生长两种状态下进行杂交的扫描叠加图片，其中白色表示该点信号达到饱和；绿色代表该基因在鸡体内的表达量高于在LB中培养的表达量，红色反之；黄色代表两者的表达量相当(图 1)。

按照公式Ratio=Cy3/Cy5计算Ratio值。基因差异表达判断标准为：Ratio值大于2表明该基因点有明显上调表达；Ratio值小于0.5表明该基因有明显下调表达。平均Ratio为这个基因3个点的平均Ratio值。“T0.05”是指在95%的水平上为差异表达的域值，计算得到的t值如果大于T0.05，则表明该基因在95%的水平上为差异表达，在“p<0.05”标记为T；“T0.01”是指在99%的水平上为差异表达的域值，与重复的个数有关，计算得到的t值如果大于T0.01，则表明该基因在99%的水平上为差异表达，在“p<0.01”标记为T。

由杂交图可以作出如下判断：E058株鸡体内(cy3)/E058株LB中培养(cy5)差异表达基因共有9个，其中上调基因为5个，下调基因为4个(表1)。

2.2.2 LB与尿液静置培养条件下的HEC4/E058的差异基因 芯片杂交结果显示：在LB中静置培养时，试验样品HEC4株与对照样品E058株的基因表达存在差异，HEC4(Cy3)/E058(Cy5)差异表达基因共有22个，其中上调基因为12个，下调基因为10个。在尿液中静置培养条件下，HEC4株与E058株的基因表达也存在差异，HEC4(Cy3)/E058(Cy5)差异表达基因共有18个，其中上调基因为10个，下调基因为8个(表2)。

表1 鸡体内外E058株差异基因表达Table 1 Up-regulated genes and down-regulated genes of strain E058 in chicks compared to those cultured in LB

表2 LB和尿液中静置培养条件下HEC4/E058的差异基因Table 2 Genes of different expression level between HEC4 strain and E058 strain in LB and urine

3 讨论

对于病原体基因表达的研究，只有在模拟宿主环境条件下进行，才会得到全面的信息，对研究病原体的致病机理才更有实效。我们曾研究E058株的致病基因在鸡组织中表达的差异，但由于组织细胞RNA相对于组织中菌体RNA占绝对优势，致使无法判定细菌毒力基因在鸡体内的表达差异。因此，本研究对接种E058株的1日龄SPF鸡采血，低速离心除去红细胞等杂质，再高速离心富集细菌，将收集的细菌提取RNA，检测显示提取的RNA质量合格，证实该方法可行。

细菌在特定环境下会上调所需要功能基因的表达，而不需要的功能基因则表现下调，这种规律同样适用于毒力基因。相对于在体外LB中培养，E058株在体内生长时差异表达的基因共有9个，其中上调基因为5个，下调基因为4个。该5个上调基因极有可能与其体内感染过程相关，可能是其重要的毒力因子。在该5个基因中，neuC、iutA、cvaC和iucCD分别与K1荚膜、气杆菌素受体、肠杆菌素V和气杆菌素有关，属于已知的可能毒力基因，而aes-15尚未被列入APEC已知的毒力基因范围[13]。除上述4个已知的毒力基因外，aes-15也将是我们研究的重点，尤其是其与E058株致病性的关系。

研究表明，UPEC在人的尿液中生长时，其毒力基因的表达，相似于其在小鼠尿道内的表达[22]。因此，本研究以尿液模拟人尿道环境，并以LB培养基作为对照，对APEC的高致病株E058和UPEC分离株HEC4进行基因差异表达，研究APEC和UPEC间的相关性。芯片杂交试验结果显示在尿液和LB中，E058株与HEC4株的差异表达基因基本相同。相对于LB培养物，尿液更接近人类尿道环境，因此在尿液培养中，HEC4株不同于LB培养物的上调基因aec-11，其在HEC4株中的功能，还需要进一步研究。

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