离子对HPLC法测定五维牛磺酸口服液中4种水溶性维生素

2011-05-17顾丽娟杨大龙冷柏榕严相平

药学与临床研究 2011年4期

顾丽娟，杨大龙，冷柏榕，严相平*

1南京医科大学第一附属医院药剂科，南京 210029；2南京工业大学江苏省药物研究所，南京 210009

五维牛磺酸口服液是多种维生素的复合制剂，主要成分有水溶性维生素B1、B2、B6、烟酰胺和脂溶性维生素D2、牛磺酸，主要用于维生素B族缺乏所致疾病的辅助治疗。4种水溶性维生素作为主要成分应加以定量控制，而我国现行的国家标准[1]以液相色谱法仅对维生素B1、B6、烟酰胺含量进行测定。该标准采用流动相为0.9%三乙胺溶液-0.5%磷酸乙腈溶液（400：1），流动相中水相比例过高，这对于碳十八柱寿命不利，且不易重现。尽管有文献报道[2-4]采用HPLC法同时测定上述4种维生素，然而本品作为营养药，在处方中含有尼泊金乙酯做防腐剂，用文献报道条件试验时，防腐剂出峰时间过长（约1.5h），无法用于本品含量测定。另有部分文献采用梯度洗脱，操作繁琐。本文建立了一个新的色谱条件，同时测定五维牛磺酸口服液中的上述4中水溶性维生素的含量。

1 仪器和试药

ALLTECH 626高效液相色谱仪。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：C18柱(4.6 mm×25 cm，5 μm)；流动相：甲醇-0.01 mol·L-1庚烷磺酸钠溶液（含0.1%冰醋酸）（50： 50）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：273 nm；进样量：20 μL。理论板数按维生素B1峰计算应不低于2000。色谱图见图1。

2.2 溶液配制

对照品溶液：精密称取维生素B1对照品约16 mg、烟酰胺对照品约9.6 mg，置同一100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀（溶液A）。精密称取维生素B6对照品约12.8 mg置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀（溶液B）。精密称取维生素B2对照品约10.4 mg置100 mL量瓶中，加冰醋酸1 mL与水75 mL，加热溶解后，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀（溶液C）。精密量取溶液A 10 mL，溶液B、C各5 mL置同一100 mL量瓶中，加水稀释至刻度。

供试品溶液：精密吸取本品2 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度。

2.3 线性试验

图1 HPLC色谱图

精密量取“2.2”项下溶液A10mL，溶液B、C各5 mL，置同一50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密吸取此溶液4、4.5、5、5.5、6、6.5、7mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。得系列浓度的标准溶液。进样测定，以相应浓度C为横坐标，以各组分峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得线性方程分别为：VB1，A=-9.335×103+2.197×104C， r=0.9996； VB2，A=4.954×103+6.461×104C， r=0.9998； VB6，A=1.103×103+1.229×104C，r=0.9998；烟酰胺，A=4.123×103+1.268×104C， r=0.9997。结果表明，4个组分的线性范围分别为12.57～21.99、2.07～3.63、2.52～4.40、2.52～4.40 μg·mL-1。

2.4 精密度、稳定性、重复性与中间精密度试验

取样品溶液，连续进样6次，记录峰面积，计算得维生素 B1、B2、B6和烟酰胺这 4个成分峰面积RSD分别为1.05%、1.94%、0.93%和0.74%。

取对照品溶液，分别于 0、2、4、6、8 h进样，记录峰面积，考察溶液放置稳定性，结果表明溶液至少在8 h内稳定。

取同一批号的本品（批号080621），共6份，照“样品测定”法项下操作，测定每份样品的含量，计算得4个成分的RSD分别为0.48%、0.89%、0.67%和1.18%。

取同一批号本品（批号0809261），分别由二位实验者在不同的时间内，分别测定含量。计算得中间精密度RSD分别为0.82%、0.77%、0.44%和0.36%。

2.5 回收率试验

按处方工艺，分别以处方量的80%、100%、140%的浓度比例，精密称取各原料、配制低中高浓度的模拟样品1000 mL。按照“样品测定”项下的方法测定含量。计算得平均回收率分别为99.8%、99.7%、99.4%和99.4%，RSD(n=9)分别为0.76%、0.92%、0.28%、0.49%。

2.6 样品测定

取3批供试品溶液进行测定，结果见表1。

3 讨论

文献报道的流动相中均含有庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠等离子对试剂，可见离子对试剂的使用对于分离测定上述四种维生素是有意义的。具体到本品，由于处方中以尼泊金乙酯为防腐剂。当有机相的比例较低时，保留时间过长。而几种维生素的极性都较大，有机相增加时，出峰太快，彼此间无法分离。而离子对试剂的引入能够有效解决这一矛盾：尼泊金乙酯不具备与离子对试剂结合的基团，其色谱行为主要与有机相的比例密切相关；而几种维生素都具碱性氮原子，能够与离子对试剂结合形成离子对，使得其疏水性增强，从而色谱保留增强，并得以彼此分离。通过调整离子对试剂的种类、用量、有机相的比例，达到了如下目的：四种主成分保留时间适当，分离良好，且尼泊金乙酯出峰时间不过长。