人脐带间充质干细胞在心肌梗塞移植治疗中的研究进展

赵先锋，徐 予，宿 昕，张雪亚

(1.河南省人民医院心血管内科 河南 郑州 450003;2.武汉大学 经济管理学院 湖北 武汉 430072)

随着社会的发展及人类生活方式的转变，冠状动脉粥样硬化造成的心肌梗塞发病率、死亡率、致残率居高不下，给国家及个人造成巨大经济负担。目前早期心肌梗塞的治疗手段包括药物治疗、经冠状动脉介入治疗(PCI)、冠状动脉旁路移植术(CABG)等，但这些治疗只能改善顿抑心肌、冬眠心肌的功能，对坏死心肌组织的恢复作用有限，只能有限改善临床症状和预后。随着心肌梗塞心肌重塑的发生，最终会导致心力衰竭，患者的生活质量逐渐下降，只能以药物，心脏辅助装置及心脏移植延长患者寿命。

近年来，干细胞研究使人们看到了新的曙光。干细胞来源于胚胎、胎儿组织、成体组织、脐带血、脐带、骨髓等，是一类能自我更新、有较强分化和再生能力、并可产生各种类型成熟组织的原始细胞。根据其发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞、成体干细胞和间充质干细胞三类。但胚胎干细胞、成体干细胞定向分化和增殖、调控的条件还没有完全弄清楚，且来源不足，临床应用受到限制。间充质干细胞(MSCs)是中胚层发育的早期细胞，因能在体内外特定环境下，分化为骨、软骨、肌肉、脂肪等间叶组织而得名。MSCs具有自我扩增和多向分化性，在发育的不同阶段和特定环境条件下，可以分化为多种组织细胞，越来越引起重视。心脏的细胞移植治疗旨在通过再生的心肌组织替代纤维组织，从而改善心脏收缩和舒张功能，为心肌梗塞治疗提供新的治疗方法。人脐带间充质干细胞是一种来源广泛、再生能力强、有较强分化潜能、免疫原性低的干细胞，近年来已经进行很多基础和临床研究，现将人脐带间充质干细胞在心肌梗塞细胞移植治疗中的研究进展概述如下。

1 人脐带间充干细胞的基础研究

1.1 人脐带间充质干细胞的来源和分离 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，内含2条脐动脉和1条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织——华尔通氏胶(Wharton’s jelly WJ)。从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells hUcMSCs)。胎儿分娩后6 h内切除夹痕和淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔，将脐带剪切成4～5 cm长的小段，排净血管内血液，用眼科剪沿血管将包裹着血管的Wharton氏胶剪下，于小培养皿内进一步剪碎培养。

1.2 人脐带间充质干细胞的培养 采用植块培养法［1］及胶原酶消化脐静脉内膜法［2］培养6～10 d均可见成纤维样细胞从植块边缘爬出，形态与骨髓间充质干细胞相似，散在分布或形成小克隆，3周左右细胞达70%～80%融合呈平行或漩涡状排列。原代可获得(5.2±1.7)×103个贴壁细胞/0.5 cm 脐带组织，细胞至少可稳定传15代，均每代扩增6.2倍。按照每根脐带中位长30 cm计算，原代平均可获3.12×107个贴壁细胞。传代后细胞呈均一的梭形，平行或漩涡状排列。

1.3 人脐带间充质干细胞的生长曲线和细胞周期

人脐带间充质干细胞接种后0～3 d处于潜伏期，细胞无明显增殖;第4天进入对数增长期，维持至第8天;之后进入平台期，倍增时间为45 h，且基本保持稳定。对处于对数增长期的细胞进行周期检测，大部分细胞处于G0/G1期，约20%细胞处于增殖的S+G2+M期，与骨髓间充质干细胞的生长周期相似。

1.4 人脐带间充质干细胞的免疫表型 流式细胞术分析表明:hUcMSCs表达粘附分子和基质细胞标记CD13，CD29，CD44，CD73(SH3)，CD90，CD105(SH2)，CD166和HLA－I，更高水平表达CD146，代表间充质干细胞的多向分化能力的标志物，不表达造血细胞标记(CD14，CD34，CD45，CD38)，不表达内皮细胞标记CD31和HLA－2DR，2DR，与骨髓源细胞相比两者表达大多数表型一致，但是脐带源细胞CD106，HLAABC的表达低于骨髓源细胞，说明hUcMSCs有相似或更低骨髓源干细胞的免疫原性，细胞移植后无免疫排斥反应。

1.5 人脐带间充质干细胞的诱导分化 人脐带源间充质干细胞利用5－氮杂胞苷(5－Aza)或二甲基亚砜诱导分化后免疫组化检测到心肌样细胞所特有的cTNI、cTNT、和心肌结蛋白。RT－PCR可以检测到心肌特异性转录因子(GATA－4)等说明人脐带源间充质干细胞能向心肌样细胞分化［3］。

2 人脐带间充质干细胞在心肌梗塞临床研究

1994年，Soonpaa 等［4］将小鼠胚胎心肌细胞(CDC)移植到正常小鼠心脏获得成功。随后，胚胎CDC在大鼠坏死心肌模型上获得分化成功，开始了干细胞移植的先河。以后大量实验证实在适宜的条件下，干细胞不仅可分化为心肌细胞，表达心肌特异的基因及蛋白质成分，而且还可分化为血管内皮细胞，参与新生血管的形成，同时干细胞还可分泌一些促进细胞分化及血管形成的细胞因子，并认为可以减少细胞凋亡。Scorsin等［5］证实干细胞移植后心脏在体功能改善。胚胎干细胞来源于种植前胚胎的细胞，可在体外生长，并能在原始未分化状态无限繁殖，具有多能性，核型保持正常。人类干细胞体外生长繁殖和分化的潜能，为急性心肌梗死(AMI)组织再生与修复提供了新的途径［6］。但由于自体胚胎干细胞很难得到，而同种异体间移植存在排异反应，且应用免疫抑制剂的副作用较大。因此人类进行干细胞移植考虑自体骨髓干细胞、周围血干细胞、脐血或脐带源干细胞［7］。

中国人民解放军海军总医院高连如等教授利用脐带华通胶来源的间充质干细胞治疗1月内新发生的STEMI和NSTEMI患者中，于发病6 h之内实施血管重建术后，4～6 d做冠状动脉灌注及其他择期实施血管重建术者，与手术同时实施脐带源干细胞移植，结果优于骨髓间充质干细胞移植。天津昂赛细胞基因工程有限公司已经开发出脐带源间充质干细胞注射液，每支1×106cells无污染，表达多种间充质干细胞特异标记，具有良好的增殖和分化潜能，经动物实验证明，对于衰老和损伤引起的多种疾病，如终末期心脏病、严重的神经损伤等具有显著的治疗效果，应用于科学、临床研究。

2.1 人脐带间充质干细胞移植的最佳剂量及时机

目前关于干细胞移植的最佳时机国际上还没有统一的标准，但国内外报道的看法比较一致。因为在AMI发生前5天的炎性反应以及2周后的瘢痕化过程均可能不利于移植细胞的生存，所以在AMI发生后7 d左右即炎性反应消退之后、瘢痕扩展之前进行干细胞移植效果较佳。Soekit等发现心肌梗死后1～2周，缺血心脏自身促血管新生因子如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的分泌。此时心脏自身促血管生成因素能够放大移植的骨髓干细胞促血管生成效应，更有利于缺血心脏的修复，而在心肌梗塞晚期细胞移植容易形成纤维瘢痕，效果不佳。但也有人认为早期细胞移植炎症反应强，炎症因子可促进干细胞分化和归巢，因此细胞移植越早越好。我们采用心肌梗塞后1周左右进行细胞移植，移植间充质干细胞剂量为106～108:剂量过低(＜105)不起作用，过高(＞108)不增加干细胞的分化效应，反而增加微血栓形成、心律失常机率，我们临床上单次用量2 ×107。

2.2 hUcMSCs的移植方式

2.2.1 经冠状动脉内注射:操作简单易行，可在PCI的手术过程中进行，目前多数动物实验和临床研究都采用这一方法。但是把高浓度的细胞液直接注入靶区容易引起细胞栓塞及心律失常。另外，经冠状动脉内注射的组织选择性较差，细胞可分散到血流经过的任何部位，并不能都到达阻塞血管支配的心肌坏死区域最需要细胞移植的部位中，有形成畸胎瘤风险。

2.2.2 直接心内膜下注射:此法通过股动脉或桡动脉将特制导管送达左心室，在X线透视下进行心内膜下注射。心内膜电机械标测系统(NOGA)提供心腔内心电图和室壁运动信息，显示异常区域(如心肌梗死部位)电激动顺序图，为心内膜下注射导管提供精确的定位，具有良好的应用前景。Ped等应用NOGA对患者进行HuMSCs心肌细胞移植，效果显著，无明显并发症发生。然而，由于创伤性，操作有一定难度，且高压下注射细胞液会造成细胞的损伤，此外还会引起心律失常，临床应用受到限制。

2.2.3 心肌内注射:在冠状动脉搭桥和换瓣等开胸手术在直视状态下直接心肌内注射，定位准确、便于检测、量化准确。但临床的开胸条件主要是冠状动脉搭桥，而冠状动脉搭桥只适用于少数心肌梗死患者，所以心肌内注射移植应用受限。

2.2.4 经静脉系统注射:这个技术最易实施，但由于存在肺、脾等脏器的首过效应，仅有少量的移植细胞达到靶区，因此，对移植细胞的数量要求大，而且静脉移植的归巢作用不及冠状动脉内移植，目前已很少应用。

2.3 hUcMSCs移植后的心功能评价 方法主要有心肌超声造影、门控心肌断层显像、组织多普勒成像、核素心脏显像，磁共振评价等。由于示踪剂对活体组织有致癌性，不能跟踪活体干细胞在人体成活的时间及直接评价干细胞在心肌内的具体功能，与正常心肌的同步收缩、舒张功能的量化手段不足，只能通过间接心脏超声射血分数、左室收缩、舒张末期内径的大小及脑钠肽的变化来监测。

3 问题和展望

HUcMSCs来源于胎盘，在临床上为废弃物，但具有分化潜力大，增殖能力强，取材方便，来源广泛等特点，征得同意后不涉及伦理问题，与捐献骨髓或采集动员外周血相比，无痛苦，感染机会少，数量大，方便并能长期稳定表达且免疫原性较低等特点。在创伤修复、局部缺血组织的血管再生和组织工程方面发挥不可估量的作用。

hUcMSCs作为心肌梗塞后坏死心肌移植新的种子细胞，细胞移植的简单途径、最佳数量、最佳时机、移植后分化、归巢、评估还没有统一的标准，以及细胞移植后心肌再生的机制可能为向心肌样细胞分化，促进血管生成，旁分泌功能，促进内源性干细胞等功能具体机制还没有完全清楚，真正广泛应用于临床还有很多工作要做。

［1］ Ma L，Fena XY，Cui BL，et al.Human umbilical cord Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells［J］.Chin Med(Engl)，2005，118(23):1987-1993.

［2］ Lu LL，Liu YJ，Yang SG，et al.Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiese-supportive function and other potentials［J］.Haematologica，2006，91(8):1017-1026.

［3］ 林晓波，何红燕，罗敏洁，等.人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究［J］.实用儿科临床杂志，2007，22(13):971-973.

［4］ Soonpaa MH，Koh GY，Klug MG，et al.Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium［J］.Science，1994，26(4):98-101.

［5］ Scorsin U，Hagege A，Marotte P，et al.Does transplantation ocardiomyocytes improve function of infarcted myocardium［J］.Circulation，1997，96(9Suppl):188-193.

［6］ Kadner A ，Zund G ，Maurus C，et al.Human umbilical cord cells for Cardiovascular tissue engineering:a comparative study［J］.EurJ Cardio-thorac Surg，2004，25(4):635-641.

［7］ Kadner A，Hoerstrup SP，Tracy J.Human umbilical cord cells:a new cell source for cardiovascular tissue engineering［J］.Ann Thorac Surg，2002，74(4):S1422-S1428.