一种精子无冷冻保护剂玻璃化冷冻新载体制备

罗树伟 林戈 卢光琇

精子库现已经成为辅助生殖技术重要组成部分，精子冷冻技术成熟是建立精子库的基础。精子的传统冷冻方法40年代以甘油为冷冻保护剂慢速冷冻法[1]，经过50年代的完善和改良，一直沿用到现在。由于冷冻保护剂的毒性作用以及在冷冻过程中冰晶形成，慢速冷冻操作不适合少量精子样本（严重少精症精子样本、睾丸穿刺和附睾穿刺精子样本）的冷冻。为了有效保存这些少量精子，国内外学者采用各种不同的载体来冷冻少量精子，这些载体就包括了透明带、cryloop环、铜环和ICSI注射针等。玻璃化冷冻最早是有Luyet在1937年提出，玻璃化冷冻可以完全避免冰晶行成对细胞的损伤，同时可以保持细胞内分子相对空间位置，自从1998年应用到人类胚胎冷冻上以来[2]，人类胚胎玻璃化冷冻越来越成为保存人类胚胎的主要的方式。精子与卵裂期胚胎不同，精子不能耐受渗透损伤，并且对冷冻保护剂毒性敏感，常规玻璃化冷冻方法不能保存少量精子，为此国内外学者采用无冷冻保护剂的方式玻璃化冷冻保存人类精子，并获得初步成功[3-5]。为了减少精子质量对结果的影响，本研究采用正常精液来研究分析一种新型精子冷冻载体冷冻效果。

1 材料与方法

1.1 精液样本的收集和处理 收集非男方因素IVF夫妇中男方精液，其中精液精子密度＞50×106/ml，a级+b级精子＞50％的精液标本列入研究对象，收集精液样本10份，精子质量评估的标准参考世界卫生组织《人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册标准》第四版[6]。将收集的精液37℃液化30～40分钟，完全液化后，采用Isolate试剂行密度梯度离心分离活动精子，300g离心20分钟，去上清，加入1ml精子洗涤液（GMOPS+5％HSA）混匀，200g离心5分钟，去上清，在精子沉淀上加入1ml洗涤液，使沉淀和上层洗涤液形成清晰的分界线，45°倾斜离心管，37℃孵育20分钟，然后取上清液体备用，并采用Makler板计数精子数目和活动精子数目。

1.2 精子伊红染色 按照世界卫生组织《人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册标准》第四版[6]配制精子伊红染色试剂，用生理盐水配制5g/L的伊红Y染液，充分溶解，然后过滤备用。将一滴洗涤后或解冻后洗涤后精子悬液与一滴伊红溶液在显微镜载玻片上充分混匀，并覆盖玻片，30秒后在400倍光学显微镜下观察，活精子不着色，死精子被染成红色。

1.3 新型冷冻载体和开放式冷冻载体的制备 新型冷冻载体的制备：将普通胚胎冷冻麦管下端3cm区域采用细砂纸将外侧面打磨粗糙。将麦管打磨区域沿麦管轴线剪一1/8圆周的细缝，选择大小合适的输液针套将麦管打磨区域套住。开放式冷冻载体的制备：按照Isachenko报道的方法制备[7]，取普通胚胎冷冻麦管，将其下端1cm区域沿轴线剪掉一半，使麦管下端1cm形成半圆形槽状。分别在载体麦管上标记好标本号和管号。

1.4 新型冷冻载体精子悬液量承载量确定 将输液针套套在打磨好的麦管下端，采用加样枪分别加入10ul、9ul、8ul、7ul、6ul、5ul、4ul、3ul、2ul、1ul精子悬液，倒置麦管及输液针套管，缓慢拉动输液针套管，最终使输液针套管脱离麦管，然后采用1ul加样枪测量输液针套管上存留的液体量，根据麦管打磨段液体存留情况和套管上存留液体量来判定新型载体液体承载量。

1.5 精子无冷冻保护剂玻璃化冷冻和解冻 新型载体精子冷冻，首先将输液针套套紧在麦管打磨区域，采用加样枪吸取5ul处理后的精子悬液加在输液针套头端，倒转麦管，使套管位于上方，缓慢上体套管，使精子悬液均匀涂布在打磨好的麦管上，然后倒转麦管，使麦管表面液体形成较均匀的液体薄层，迅速将麦管浸入液氮中，将麦管置外套管内。新型载体精子解冻，将精子洗涤液10ml加入到15ml锥形离心管中，37℃预热30分钟，从液氮中迅速取出冷冻麦管并置预热好10ml洗涤液中，同时不停搅动，使迅速解冻，连续解冻5管，300g离心5分钟，去上清，加洗涤液0.1ml，37℃孵育20分钟，镜下计数活动精子的数目，同时行精子伊红染色，计数活精子和死精子数目。开放式载体精子冷冻，将洗涤好的精子悬液1ul，加入开放式载体下端的凹槽中，距离下端约0.5cm。迅速精开放式麦管侵入液氮中，将麦管置外套管内。开放式麦管载体精子解冻方法同新型载体精子解冻方法。

2 结果

2.1 新型精子冷冻载体可有效承载5ul精子悬液形成液体薄膜通过在输液针套上加入不同量的精子悬液、麦管打磨段液体存留情况及套管上存留液体量，当加入精子悬液量≥7ul时，液体量存留量＞1ul，颠倒麦管可以看到明显液体流动，加入6ul精子悬液时，存留液体量约1ul，当加入5ul精子悬液时，存留液体量＜1ul，加入液体量＜4ul时，套管上未有液体，麦管下端存在部分区域未涂抹液体。在显微镜下观察2种载体上的精子，在新型载体上形成一薄层液体，液体中可见精子的存在，同时我们也发现新型载体也存在部分区域无薄层液体覆盖。

2.2 新型精子冷冻载体具有良好的玻璃化冷冻效果 新型精子冷冻载体和开放式精子冷冻载体上精子冷冻后，以处理后未冷冻前精子悬液为对照[活动率（93±4）％，存活率（96±3）％]，新型载体和开放式载体解冻后精子活动率和存活率均下降，活动率分别为（70±2）％和（65±3）％，存活率分别为（74±4）％和（66±3）％（P＜0.05），新型载体明显优于开放式载体。

3 讨论

目前胚胎玻璃化冷冻技术已经广泛应用到人类辅助生殖技术，玻璃化冷冻也慢慢应用到人类胚子中，如人类卵母细胞的冷冻，玻璃化冷冻技术是在人类辅助生殖技术中起着重要的作用，具有逐渐取代人类胚胎慢速程序冷冻的趋势。玻璃化冷冻过程中需要加入高浓度的冷冻保护剂（30％～50％），慢速冷冻则需要5％～7％冷冻保护剂的浓度，高渗透压不利于精子冷冻，然而，精子具有实现无冷冻保护剂玻璃化冷冻的条件，精子含有大量的蛋白质、糖和其他成分，在精子内估计可达45％～77％，而在卵裂球和卵母细胞中只占有20％～25％[4]。玻璃化冷冻和解冻的速度与冷冻保护剂的浓度呈现负相关，也就是说，高浓度的冷冻保护剂，需要相对较低的冷冻速度就可以实现玻璃化冷冻，冷冻的速度越快，实现玻璃化冷冻所需要冷冻保护剂的浓度越低[8]，当精子冷冻速度达到一定限度时，在精子内部并没有见到冰晶的形成[9]。影响玻璃化冷冻的因素：液体的体积、溶质浓度、液体导热性能、液体玻璃化温度[10]，容易调整的因素为液体的体积，提高冷冻和解冻速度的方法降低液体体积和增大表面积/体积比，采用不同的载体来实现，冷冻载体选择很重要，所以提高精子无冷冻保护剂玻璃化冷冻的重点就放在载体的设计上，目前比较常用的冷冻载体为loop环，loop环的液体承载量约20ul，所形成的液体薄层平均厚度为0.07cm，由于双面接触液氮，实际有效厚度为0.035cm，开放式载体精子悬液的液体承载量为1ul，假设其形成半球形，液体的厚度为球体半径，为0.08cm，而本实验所采用的新型冷冻载体的液体存在量约为5ul，麦管的直径为1mm，如果液体精子悬液均匀涂布在麦管外表面，精子悬液可形成0.008cm，所形成液体厚度远薄于开放式载体。新型载体与开放式载体相比较，所承载的精子液体量较多，但相对loop环载体承载量要小，新型载体存在的不足有：1）精子悬液不能均匀涂布在麦管外表面，可以考虑对麦管的内表面进行打磨，打磨的凹槽为螺旋形，由于表面张力的作用，精子悬液应该可以均匀涂布在麦管内表面，同时对麦管材料进行改良，用亲水性材料制作麦管，以改善精子悬液的涂布，形成均一液体薄层；2）液体承载量相对较小，可以考虑适当加深凹槽的深度和凹槽长度，同时提高精子密度以减少精子悬液量。由于目前实验条件所限制，不能在麦管内表面打磨细小凹槽，无法对新型载体进行进一步改良。总的来说，本实验所采用的新型载体能有效承载精子进行精子无冷冻保护剂玻璃化冷冻，可作为精子无冷冻保护剂玻璃化冷冻的载体，并且具有改良优化的空间。

[1]Polge C,Smith,AU,et al.Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures[J].Nature,1949,164（4172）：666-676.

[2]Vajta G,Holm P.Open Pulled Straw（OPS）vitrification：a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos[J].Mol Reprod Dev,1998 51（1）：53-58.

[3]Nawroth F,Isachenko V.Vitrification of human spermatozoa without cryoprotectants[J].Cryo Letters,2002,23（2）：93-102.

[4]AbdelHafez F,Bedaiwy M.Techniques for cryopreservation of individual or small numbers of human spermatozoa：a systematic review[J].Hum Reprod Update,2009,15（2）：153-164.

[5]蒋凌英,靳雷,朱桂金,等.精子冷冻环无保护剂玻璃化冷冻方法的初步研究[J].生殖医学杂志,2006,15（4）：234-236.

[6]世界卫生组织.WHO人类精液及精子-宫腔黏液相互作用实验室检验手册[M].4版.北京：人民卫生出版社,2001：51.

[7]Isachenko V,Isachenko E.Clean technique for cryoprotectant-free vitrification of human spermatozoa[J].Reprod Biomed Online,2005,10（3）：350-354.

[8]Fahy GM,MacFarlane DR.Vitrification as an approach to cryopreservation[J].Cryobiology 1984,21（4）：407-426.

[9]Morris GJ.Rapidly cooled human sperm：no evidence of intracellular ice formation[J].Hum Reprod.2006,21（8）：2075-2083.

[10]sachenko E,Isachenko V.Vitrification of mammalian spermatozoa in the absence of cryoprotectants：from past practical difficulties to present success[J].Reprod Biomed Online,2003,6（2）：191-200.