神经营养因子对耳蜗螺旋神经元的作用

刘涛 综述 窦艳玲 审校

感音神经性听力损失主要源自耳蜗毛细胞和/或螺旋神经元的损伤和退化，耳蜗螺旋神经元(spiral ganglion neuron，SGN)是传导听觉信息的一级神经元，噪声、感染、耳毒性药物和衰老等诸多因素直接或者间接使螺旋神经元受损，可导致感音神经性听力损失，而哺乳动物螺旋神经元的再生能力非常低，因此保护螺旋神经元或者修复受损的螺旋神经元对恢复听力有关键性的作用。神经营养因子是神经细胞存活的依赖因子，是成熟神经元功能的调控因子，也是神经元受损和病变损伤时保护和促进其再生的必需因子。近年来，为了更好地提高人工耳蜗的效能、对神经营养因子在螺旋神经元生长和损伤修复过程中的作用研究不断进展，神经营养因子在螺旋神经元发育、损伤修复、防止退化及维持其正常生理功能中的重要作用逐渐被揭示[1～3]。

与听觉系统发育密切相关的神经营养因子有神经营养因子-3(neurotrophin-3, NT-3)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、胶质细胞神经营养因子(glial cell line- derived neurotrophic factor, GDNF)、白血病抑制因子(Leukaemia inhibitory factor, LIF)等[4]。目前大多学者认为，毛细胞可以合成和分泌多种营养因子支持和保护螺旋神经元，且神经营养因子在耳蜗内保持较高表达水平是发挥其活性作用的关键，毛细胞受损后，螺旋神经元失去神经营养因子的保护作用发生退行性变。Lefebvre等(1994)体外研究表明，BDNF、NT-3、NT-4/5、GDNF、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、纤毛神经营养因子(ciliary neuroteophic factor, CNTF)等都能促进体外培养的新生大鼠SGN的存活[5]。在螺旋神经元原代培养过程中适时适量地加入神经营养因子已是提高螺旋神经元的纯度和活性的重要手段之一。

1 神经营养因子对螺旋神经元的作用

在体实验证明了直接在耳蜗内注入神经营养因子特别是BDNF能提高耳聋后螺旋神经元的存活率[6]。BDNF作为神经营养因子中的一员，在神经系统发育、正常生理功能维持和神经受损修复过程中都发挥着重要作用，不仅调节着听觉神经元的成熟、增殖、分化，而且对前庭神经元和部分听觉神经元的存活有促进作用[4]。BDNF可能通过维持细胞内钙离子浓度、减少自由基损伤、抑制细胞凋亡和(或)促进细胞功能恢复稳定而起到保护作用。研究表明在螺旋神经元上有BDNF高亲和性受体，在螺旋神经元神经突起发育的过程中，BDNF在毛细胞内高浓度表达，将BDNF注入耳蜗内可阻止失去毛细胞支持后螺旋神经元的变性退变[7]。Xie等[8，9]研究发现BDNF基因工程细胞具有很强的生物学活性，能够促进螺旋神经元的生长，在螺旋神经元氧化损伤时具有明显的保护作用。BDNF能减少听觉神经元的损失，而且促进轴突的再生，因而可能提高人工耳蜗植入的效果[10]。在体外螺旋神经元培养过程中，BDNF能刺激单离培养的未成熟神经元轴突的生长[10]。翟所强等[11]对噪声损伤模型小鼠给予外源性的BDNF后，其较对照组螺旋神经元的存活量有显著改变，证明BDNF能保护螺旋神经元。Darius等[12]研究发现BDNF体外基因治疗对螺旋神经元的保护作用耳蜗底回较蜗顶更明显。Martijn等[13]的研究发现BDNF提高螺旋神经元存活率的作用可持续到停止治疗后2周，在BDNF治疗后，治疗组动物的阈上电诱发听性脑干反应幅值显著大于耳聋动物，与正常听觉动物差异无统计学意义，在停止给予BDNF后，治疗组的阈上电诱发听性脑干反应幅值也不会显著降低。应用神经营养因子处理后的螺旋神经元保存了电应激性，给予神经营养因子动物的电诱发听性脑干反应潜伏期较对照组(灌入人工外淋巴液的耳聋动物)明显缩短[14～16]，这些均提示神经营养因子的作用可持续。在人工耳蜗的实验中，通过渗透泵给发育中动物的耳蜗内注入BDNF，可观察到在植入电极上有包绕髓鞘的神经轴突向鼓阶萌芽[17]。

NT-3是一种多功能的神经营养因子，对神经系统发育及维持其正常生理功能有重要意义，是迄今发现的维持螺旋神经元存活的作用最显著的神经营养因子之一[18]。NT-3是Ⅰ型螺旋神经元的主要生长因子，可作为小鼠螺旋神经元离体细胞培养的生存因子。Zhou等[19]研究发现NT-3对常规神经元有维持存活作用，对缺氧神经元有明显保护作用，能够促进神经元轴突生长，降低缺氧造成的损伤，促进神经元的存活，其机制可能是通过上调c-jun基因的表达而促进神经元的生长，提高其活力。耳蜗毛细胞能分泌NT-3，当毛细胞损伤后，NT-3分泌减少，可继发引起神经纤维和螺旋神经元的变性死亡，而当耳毒性药物、兴奋性刺激等损伤后，给予大量外源性NT-3可明显减少螺旋神经元的变性死亡[20]。Bibel等[21]研究发现在先天性缺乏BDNF和NT-3或其受体的小鼠中，感觉神经元严重缺失，NT-3基因敲除小鼠的螺旋神经元严重缺失，细胞数量明显低于正常水平，由于无NT-3表达，Ⅰ型螺旋神经元缺失。Chen等[22]证实在体外培养中，NT-3的浓度与螺旋神经元的生物活性正相关。研究证明，利用单纯疱疹病毒介导产生神经营养因子-3能减弱顺铂对成年老鼠外周听觉系统的毒性，证明在活体内通过神经营养因子-3基因治疗，有希望预防化学药物导致的听力损失，并可能预防老年听觉退化[23]。

GDNF是迄今发现的活性最强的神经元神经营养因子之一，是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一员，体内很多细胞可以合成GDNF，影响神经元的发育和存活，它可通过磷酸肌醇3激酶(PI3-K)、G蛋白、cAMP和MAP激酶等途径介导GDNF信号转导，维持未成熟神经元的生存、分化和增殖，支持成熟神经元的生存适应，介导神经元的可塑性，能抑制凋亡而延长受损和退变的神经元的生存时间，修复其功能。有研究表明，GDNF在新生大鼠内耳的内外毛细胞中表达，在成熟大鼠内毛细胞中也有表达，GDNF的受体GFRα-1、酪氨酸激酶受体Ret在螺旋神经元上也有表达[24]。Ylikoski等[25]向豚鼠鼓阶内缓慢注入GDNF后，观察强噪声下GDNF对听神经的保护作用，结果发现GDNF可以明显提高噪声损伤后螺旋神经元的存活率。噪声暴露后，耳蜗内GDNF的mRNA表达水平明显加强[26]，GDNF对噪声、耳毒性药物等引起的听力损失具有明显保护作用。Yagi等[27]利用腺病毒载体进行基因治疗证明应用GDNF或其他因子进行基因治疗后，内耳毛细胞损失后螺旋神经元的存活率显著提高。Stover等[28]通过RT-PCR及Western blot免疫化学的方法在螺旋神经元内观察到了GDNF、GFRal、Ret三种蛋白的分布。朱雅颖等[29]研究表明耳蜗内长期灌注GDNF对耳毒性药物损伤后残余的螺旋神经元有保护作用，可避免细胞进一步丢失，对损伤的细胞可能有修复作用。

2 神经营养因子之间的相互影响

在活体外实验中，BNDF和CNTF协同作用较各自作用能更有效提高螺旋神经元的存活率[30]。联合应用BDNF和成纤维生长因子-1能更有效提高螺旋神经元存活和促进神经元周围突的生长。

研究发现神经营养因子BDNF和NT-3在活体和离体培养中都是维持听觉上皮和听觉神经元生存的重要物质。内耳毛细胞释放神经营养因子-3和脑源性神经生长因子对螺旋神经元存活是基本必须的[31]，并且BDNF和NT-3对螺旋神经元的存活、生长和功能有调节作用，并相互协调相互影响[32，33]。BDNF和NT-3可通过结合其高亲和力受体影响螺旋神经元生长和发育过程，均能促进神经元的存活，其中BDNF效果更明显。近年来发现BDNF在螺旋神经元生长和发育过程中主要促进胞体发育，而NT-3主要促进轴突分化和生长，并且发现BDNF、NT-3均能刺激分离培养的未成熟螺旋神经元的轴突生长，但对成熟的螺旋神经元，无论是BDNF还是NT-3均不能促进轴突生长，可能在发育成熟的神经系统中，神经营养因子的作用发生了改变。

在GDNF对内耳保护作用的研究中发现NT3对GDNF的增强作用具有特异性[36]，联合应用GDNF和NT-3能够显著提高SGN体外培养的存活率，NT-3能增强GDNF诱导的Ret酪氨酸磷酸化，因而使螺旋神经元发育存活所需的Akt磷酸化反应大大增强。有研究表明在耳毒性药物制造的耳聋动物模型中，应用NT-3和GDNF在耳蜗共同转导，不仅能够增强神经营养因子对耳蜗的保护，而且能降低耳毒性药物对听力的损伤[34]。GDNF和NT-3的联合作用是协同效应，可显著提高螺旋神经元的存活率[35]。

CNTF和LIF也具有促进螺旋神经元的轴突生长的作用，而同时应用LIF与BDNF时，两者具有协同作用，可促进神经元轴突的生长[37]。在螺旋神经元培养过程中，LIF与NT-3因子也相互影响其作用的发挥，LIF能间接增强NT-3的诱导效应，促进神经元的存活[11]。

3 展望

进行性的SGN变性部分原因是因为失去毛细胞支持后缺少神经营养因子，因此，神经营养因子被认为可以阻止和延缓SGN的变性。噪声损伤后，内耳内BDNF、GDNF、NT-3等神经因子mRNA表达均有增强，内耳毛细胞及螺旋神经元损伤时，各种神经营养因子可能协同作用，而非一种因子的作用。近年来，对神经营养因子在内耳的研究已广泛开展，但仍然处于初步阶段，对内耳兴奋性刺激、耳毒性药物、缺血性损伤后螺旋神经元的保护和损伤的研究尚有待进一步发展。利用耳蜗内持续灌注、通过病毒载体的基因治疗等方法，均在动物实验中证明了神经营养因子能保护感音神经性聋残余神经细胞，可避免更多的细胞丢失，也能提高靶神经元的存活。螺旋神经元的存活数量和生物活性尤为重要，利用神经营养因子的治疗，很可能使人工耳蜗植入更有效发挥作用[9]。研究神经营养因子对螺旋神经元的保护与细胞修复、分子机制以及将来可行的治疗方法将为治疗感音神经性聋开辟新途径。

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