试管扩散法检测牛乳中β-酰胺类抗生素残留研究

吴 瑕，邵 辉，王 鑫，张兰威

（1.东北农业大学成栋学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江龙丹乳业有限公司，哈尔滨 150046；3.哈尔滨工业大学食品科学与遗传工程研究院，哈尔滨 150001）

抗生素在畜牧业的广泛应用，不可避免地造成牛乳中的抗生素残留。具有β-内酰胺环的抗生素如青霉素G、阿莫西林、氨苄青霉素等在奶牛养殖业中常用于治疗奶牛乳房炎，由于其廉价和广谱的抗菌性而被大量且频繁地超剂量使用，因此导致了牛乳中高浓度的β-内酰胺类抗生素残留。牛乳中抗生素残留的原因主要是非治疗目的用药、治疗目的用药和非法人为掺杂[1]。

对抗生素有过敏体制的人服用抗生素残留的牛乳后，会发生过敏反应如皮疹、过敏性休克等[2]。李银生曾报道，英国一对青霉素高度敏感的病人，使用含约10 IU·mL-1的青霉素的商品牛乳后，发生了变态反应[3]。长期饮用则会抑制人体肠道中敏感菌群的生长，并会导致人体对抗生素产生耐药性，给临床治疗带来不可估量的麻烦[4]。从乳品加工的角度看，原料乳中抗生素残留严重影响干酪、黄油、发酵乳的起酵和后期风味的形成[4-6]。因此，牛乳中的β-内酰胺类抗生素残留一直是各国政府和食品安全机构关注的重点。WHO和欧盟法典规定的青霉素G在牛乳中的最大残留限制（MRL）为4μg·kg-1，FDA规定的最大检出量为5μg·kg-1[7]。

用于检测牛乳中青霉素G残留的方法，目前国内主要依据国家标准GB4789.27-94进行，此方法操作简单，比较适合基层单位使用，但其灵敏度低，对乳中青霉素G的检测限仅为0.04 U·mL-1，已不适应国际需要。国外已研制出检测牛乳中β-内酰胺类抗生素残留的各种类型的试剂盒，如以微生物受阻法为原理的Delvotest试剂盒、免疫受体检测试剂盒如SNAP试剂盒等，但因受到使用成本、操作难易程度、对主要设备要求以及供货连续性等众多因素的影响，还没有在我国得以广泛推广[8]。

试管扩散法是以微生物受阻法为基本原理，用嗜热脂肪芽孢杆菌作为指示菌，在培养基中加入指示剂，当牛乳中无抗生素残留时，嗜热脂肪芽孢杆菌在牛乳中生长产酸使指示剂变色；若牛乳中有抗生素残留，则嗜热脂肪芽孢杆菌的生长受到抑制，指示剂保持紫色不变。依据这一现象，确定牛乳中β-内酰胺类抗生素残留。本研究的目的是比较试管扩散法同TTC法（GB4789.27-94）的优劣，从而确定试管扩散法在实际应用中的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus，Bs）（中科院微生物研究所）。

1.1.2 主要培养基

胰蛋白胨大豆（琼脂），平板计数琼脂。

1.1.3 主要试剂及原料

青霉素G、氨苄青霉素、苯唑青霉素（新青霉素Ⅱ）、头孢吡啉（头孢菌素Ⅷ）、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶（美国SIGma公司）；羟氨苄青霉素（阿莫西林）、头孢氨苄（先锋霉素Ⅳ）（国家药检所）；苯基丁氮酮（法国Vetam公司）；脱脂乳粉和全脂无抗乳粉（购于国家乳品检测中心）；溴甲酚紫、TTC（天津科密欧化学试剂开发中心）；SNAP试剂盒（龙丹乳品公司）。

1.2 方法

1.2.1 试验用不含抗生素的牛乳

无抗牛乳:由无抗全脂奶粉复原而成，浓度为10%（W/V），并用SNAP试剂盒检测以确定其是无抗生素残留牛乳样品。

1.2.2 抗生素残留奶样的制备

将抗生素贮备液与经过检测证明无抗生素残留的奶样混合制成浓度为0.25×MRL、0.5×MRL、1.0×MRL、1.5×MRL和2.0×MRL五个浓度的抗生素残留奶样。

1.2.3 Bs菌液的制备

把标准菌株嗜热脂肪芽孢杆菌保存于胰蛋白胨大豆琼脂斜面，每3周转种1次。以下面方法制备芽孢悬液:接种芽孢培养基，于64±2℃培养，当80%芽孢形成时（一般需72 h）即可停止培养，取出培养液离心，5000 r·min-1离心15 min，倾去上清夜，再次把细胞悬浮于灭菌生理盐水中并再次离心，如此反复洗涤，最后把洗涤过的芽孢悬浮于30mL灭菌生理盐水中，并于4℃保存。芽孢悬液能保存6～8个月。用准备好的试验平皿定期检查活力。制备好的芽孢悬液采用生理盐水进行梯度稀释，选取适当稀释度涂布于平板计数培养基上，55℃24 h培养后，用标准平板计数方法计算，应达到107cfu·mL-1。

1.2.4 试管扩散法检测过程

检测时检测培养基分装到18 mm×180 mm的试管中，待用，检测前，先将受检乳样80℃处理2 min，冷却到室温后加入苯甲基丁氮酮，吸取待检样品加到已装有培养基的试管中，然后将加入了受检乳样的试管经70℃水浴10 min后放入63℃水浴中，检测时用无抗生素残留牛乳作为阴性对照，阳性对照浓度为2.5×MRL。结果判断的时间以阴性对照由紫色变为黄色的时间为准。试管扩散法检测6种β-内酰胺类抗生素，每个浓度重复30次，得到试验结果的确定依据显色判断标准如表1所示。

1.2.5 TTC法操作步骤

按照GB4789.27-94操作。本试验采用TTC法检测6种β-内酰胺类抗生素时，每个浓度重复4次，每次做2个平行。

1.2.6 实测结果分析

由牛奶收购站及市场采集鲜牛乳样品70份，同时用试管扩散法、TTC法进行对比测试，为了进一步证实，同时采用SNAP检测试剂盒进行验证。比较三种方法进行检测得到的阳性率，从而比较试管扩散法和TTC法在实际应用中的优劣。

表1 试管法结果判断颜色依据Table1 Colour judgement basis of results by tube diffusion test

2 结果与分析

2.1 试管扩散法检测6种β-内酰胺类抗生素

试管扩散法检测6种β-内酰胺类抗生素得到的结果见彩版Ⅰ。

彩版Ⅰ中1号与2号试管培养基变为黄色表示结果为阴性，3号试管变为黄紫色表示结果为可疑，4号和5号两个试管变为紫色表示结果为阳性，6号试管为未添加奶样的检测培养基。由彩版Ⅰ可以看出，检测结果的颜色梯度较为明显。符合表1中试管扩散法结果判断依据中对颜色的规定。

2.2 试管扩散法检测6种β-内酰胺类抗生素的检测限

检测时，每个浓度重复30次，结果见表2。

由表2可以看出，试管扩散法检测6种β-内酰胺类抗生素可以达到1.0×MRL的残留浓度，对于0.5×MRL残留浓度的检测上，头孢氨苄不能检出，其他5种抗生素阳性检出率不足90%，因此试管扩散法检测6种β-内酰胺类抗生素残留的检测限为1.0×MRL，符合欧盟法典规定的牛乳中6种β-内酰胺类抗生素残留的最大残留限制（MRL）[7]。

表2 试管扩散法检测6种β-内酰胺类抗生素得到的结果（n=30）Table2 Results of testing 6 kinds of β-lactam antibiotics by test tube method(n=30)

2.3 用TTC法检测6种β-内酰胺类抗生素的检测限

用TTC法检测6种药物残留的结果如表3所示。

2.4 试管扩散法实际应用情况结果分析

由牛奶收购站及市场采集鲜牛乳样品70份，同时用试管扩散方法和TTC法进行对比试验，为了进一步证实结果的可靠性，同时采用SNAP分析方法进行验证。用3种方法测试得到的阳性率如表4所示，具体的分析结果如表5、6和7所示。

表3 试管扩散法和TTC法检测6种药物残留的结果（n=4）Table3 Residue results of 6 kinds of drug by the tube diffusion test and TTC(n=4)

表4 70份牛乳样品检验结果Table4 Detecting results of 70 milk samples

表5 试管扩散法和SNAP试剂盒检测结果比较Table5 Comparison of the detecting results between test tube diffusion and SNAP method

表6 试管扩散法和TTC法检测结果比较Table6 Comparison of the detecting results between test tube diffusion and TTC method

表7 TTC法和SNAP试剂盒检测结果比较Table7 Comparison of the detecting results between TTC and SNAP method

由表5可以看出，试管扩散法和SNAP检测法具有较高的一致性。试管扩散法检测为阳性的14份样品，经SNAP试剂盒检测结果也为阳性，而试管扩散法检测为阴性的5份样品经SNAP试剂盒检测结果为阳性，原因可能是奶样中药物残留的浓度接近SNAP法的检测限（青霉素G3.5μg·kg-1，头孢吡啉3.5μg·kg-1）但是低于试管扩散法的检测限（青霉素G:4μg·kg-1头孢吡啉，头孢吡啉:60μg·kg-1）。用试管扩散法检测为阳性的3份样品经SNAP法检测为阴性，原因可能是奶样中药物残留的浓度高于试管扩散法的检测限（氨苄青霉素和羟氨苄青霉素的检测限为4μg·kg-1）但低于SNAP法的检测限（氨苄青霉素的检测限为8.2μg·kg-1，羟氨苄青霉素检测限为8μg·kg-1）。

由表6可以看出，经试管扩散法检测为阳性的17份样品，经TTC法检测只有4份为阳性，其余结果均为阴性，原因是TTC法检测为阳性的样品残留浓度较高，而TTC法检测为阴性的样品残留浓度低于TTC法的检测限但高于试管扩散法的检测限（1.0×MRL），因此TTC法在检测限上已经不符合国际要求了。表7也说明了这个问题，由SNAP法检测为阳性的19份样品，TTC法只检出了4份阳性，其余15份则检测为阴性，从SNAP的读数仪上可以看出TTC法检出的15份阴性样品显示的数值较大，即残留的浓度较高，因此说明TTC法已不适应现实需要了。

3 讨 论

从检测限上比较，试管扩散法能够检测β-内酰胺类抗生素中的多种抗生素残留，检测限符合国际标准1.0×MRL，而TTC法检测青霉素G残留的检测限已不符合国际标准，而对于β-内酰胺类抗生素中除青霉素G以外的其他抗生素残留的检测未作说明，经本试验检测，TTC法不能检出等于或低于国际标准1.0×MRL的β-内酰胺类抗生素残留；试管扩散法同AOAC认证的方法SNAP试剂盒具有较高的一致性，说明试管扩散法可以进一步开发为检测牛乳中β-内酰胺类抗生素残留的商业方法。从检测时间上比较，TTC法检测时间至少3.5 h，而试管扩散法检测时间为3 h 10 min；虽然有所缩短，但程度不大，这也是试管扩散法存在的不足。接下来的研究工作将从缩短试管扩散法的检测时间入手，可尝试通过诱变育种筛选出产酸时间较短的嗜热脂肪芽孢杆菌，或者将微生物法和免疫受体法结合起来等研究方法，以达到缩短检测时间的目的。

4 结论

研究结果表明，用试管扩散法检测牛乳中的β-内酰胺类抗生素残留有一定的研究意义，较之于其他微生物方法，该方法操作简单易于掌握，不需要特殊仪器，且灵敏度能够达到国际要求；与国际认证的标准方法具有较好的协同性。唯一不足的，也是关键就是试管扩散法与国际上商业检测方法比，检测时间偏长为3 h 10 min，相信在进一步研究后，此方法可应用于牛乳中青霉素G残留量的检测。

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