青春双歧杆菌凝固型酸奶研制及选择性培养基比较

刘 韩，关 宏，杨文钦，张 琪，韩明宇，刘吉成*

（1.齐齐哈尔医学院微生态工程技术中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

凝固型酸奶作为一种集营养、保健、味美于一体的复合型酸奶，其研制和开发对扩大酸奶制品在整个乳制品行业的竞争力，具有一定的积极作用[1]。近几年，酸奶在国内外市场的销售量日益增长，并已从大城市迅速发展到中小城市，因此，开发多种类型的酸奶制品势在必行[2]。凝固型酸奶对原料要求高，加工过程中一般不添加食品添加剂，其中乳酸菌活菌数和蛋白质含量较高，具有增强免疫功能、调节血脂和胃肠道微生态平衡、保护肝脏、防癌抗癌抗衰老等多方面调节机体生理功能和营养保健作用的一种良好乳制品[3-4]。

双歧杆菌是健康个体肠道中的优势菌，对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、抗肿瘤、改善人体代谢等多种生理作用，基于双歧杆菌的重要生理功能和人体健康的关系，国内外多种食品与医药双歧杆菌微生态制剂相继问世，品种已达70多种[5-8]。在含双歧杆菌的食品制剂中，只有当双歧杆菌活菌数达到106cfu·mL-1以上，才能起到益生菌的生理功效，因此，研究简便易行的双歧杆菌选择计数方法至关重要，文献报道通过在MRS培养基中添加抗生素、替换培养基碳源和添加显色底物等方法可以对双歧杆菌进行选择性计数，如NPNL-MRS、OGMRS、LP-MRS、Bile-MRS、NNL-MRS、XGal-MRS、MRS-raffinose培养基等[9-14]。

本研究结合牛奶和青春双歧杆菌对人体的有益作用，研究出具有独特风味、营养保健的青春双歧杆菌凝固型酸奶；比较几种培养基对三种发酵剂以及青春双歧杆菌凝固型酸奶活菌计数结果，解决了保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和青春双歧杆菌同时存在条件下青春双歧杆菌活菌计数问题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鲜牛奶、白砂糖。

1.1.2 菌种

保加利亚乳杆菌23402（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus,LB）、嗜热链球菌23502（Streptococcus thermophilus，STR）、青春双歧杆菌23001（Bifidobacteria adolescentic，BA）均保藏于齐齐哈尔医学院微生态工程技术推广中心。

1.1.3 培养基及试剂

MRS培养基、Bile-MRS培养基（MRS培养基中添加牛胆汁粉1.5 g·L-1）、XGal-MRS培养基（MRS培养基中添加5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖100μmol·L-1）、LP-MRS 培 养 基（Lithium Propionate MRS,MRS培养基中添加氯化锂4 g·L-1和丙酸钠6 g·L-1）和LM-MRS培养基（Lithium Mupirocin MRS,MRS培养基中添加莫匹罗星锂盐50 mg·L-1）[9-14]。

1.1.4 仪器与设备

厌氧培养箱（美国SHEL LAB公司）；高压蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50A）（上海博迅实业有限公司）；显微镜（CX31）（日本奥林巴斯公司）；高压均质机（SLS-60-70）（上海申鹿均质机有限公司）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；海尔冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 青春双歧杆菌凝固型酸奶的制备及品质检测

1.2.1.1 发酵剂的制备

在厌氧条件下，利用MRS培养基对青春双歧杆菌冻存菌种进行复苏后，将其接种到青春双歧杆菌工业化培养基中连续传代3～4次[15]，4℃冰箱保存作为青春双歧杆菌发酵剂；利用MRS培养基对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻存菌种进行复苏后，将其接种到10%脱脂乳中连续传代3～4次，4℃冰箱保存作为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂。

1.2.1.2 生产工艺流程

鲜乳→净化→配料→均质→灭菌→冷却→接种→灌装→发酵

1.2.1.3 青春双歧杆菌凝固型酸奶生产工艺确定

白砂糖添加量、接种量、菌种比例和发酵时间是影响青春双歧杆菌凝固型酸奶感官品质的主要因素，通过正交试验以感官评价作为标准选择出青春双歧杆菌凝固型酸奶的最佳生产工艺[16]。正交因素水平见表1。

表1 正交因素水平Table1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.1.4 检测方法

感官评价:选择齐齐哈尔医学院微生态工程技术推广中心5名教师，于饭后2 h进行品尝，品尝前漱口。感官评定内容以颜色、组织状态、凝固状态、是否有乳清析出和口感为评分指标。每项指标由5人评分，取其平均值，感官评分标准见表2。

滴定酸度:按GB 5413.34-2010方法测定（°T）。

理化指标:蛋白质参照GB 5009.5-2010、脂肪参照GB 5009.46-2010、非脂乳固体参照GB 5413.39-2010方法测定。

微生物指标:大肠菌群参照GB 4789.3-2010、沙门氏菌参照GB4789.4-2010、金黄色葡萄球菌参照GB 4789.10-2010、霉菌和酵母菌参照GB4789.15-2010、乳酸菌参照GB 4789.35-2010方法检测。

表2 感官评分标准Table2 Sensory rating criteria

1.2.2 选择性培养基比较

1.2.2.1 三种发酵剂在不同培养基上生长情况的比较

使用MRS培养基、Bile-MRS培养基、LMMRS培养基、XGal-MRS培养基和LP-MRS培养基，采用平板菌落计数法分别对保加利亚乳杆菌发酵剂、嗜热链球菌发酵剂、青春双歧杆菌发酵剂三个样品进行菌落计数。

1.2.2.2 青春双歧杆菌凝固型酸奶中三种乳酸菌计数

结合MRS培养基和LM-MRS培养基对青春双歧杆菌凝固型酸奶进行平板菌落计数，建立分别检测三种乳酸菌活菌数的方法。

2 结果与分析

2.1 青春双歧杆菌凝固型酸奶生产工艺的确定

本试验采用直观分析方法，对表3中各因素K值及R值的大小进行比较，由极差R得知C＞D＞B＞A，说明发酵时间对产品品质影响较大，其次是菌种比例，然后是接种量和白砂糖添加量。从K值可以看出青春双歧杆菌凝固型酸奶最佳生产工艺为A3B2C2D2。即，白砂糖添加量为8%、接种量3%、LB∶STR∶BA=1∶1∶4、培养4 h。产品酸甜适中、无乳清析出且凝固状态及细腻度极佳。

表3 发酵工艺参数优化设计及结果Table3 Design and results of optimization of fermentation parameters

2.2 青春双歧杆菌凝固型酸奶质量检测结果

2.2.1 理化指标检测

青春双歧杆菌凝固型酸奶理化指标:蛋白质2.9%，脂肪3.2%，非脂乳固体12.9%，滴定酸度110°。

2.2.2 微生物指标检测

青春双歧杆菌凝固型酸奶微生物指标:乳酸菌1.65×109cfu·mL-1，未检出大肠菌群，未检出致病菌，未检出霉菌及酵母菌。

2.3 选择性培养基的比较结果

由表4可知，三种乳酸菌均可在MRS培养基和XGal-MRS培养基上生长，且活菌数无明显差别；Bile-MRS培养基对保加利亚乳杆菌有明显的抑制作用，对嗜热链球菌和青春双歧杆菌无抑制作用；LP-MRS培养基对青春双歧杆菌无抑制作用，对保加利亚乳杆菌有明显的抑制作用，对嗜热链球菌有一定的抑制作用，当嗜热链球菌浓度低时抑制作用明显，当嗜热链球菌浓度高时抑制作用减弱；三种乳酸菌在XGal-MRS培养基均形成蓝色菌落，无法从菌落颜色上区分三种乳酸菌；LM-MRS培养基对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌有明显的抑制作用，对青春双歧杆菌无抑制作用，平板照片见彩版Ⅰ。

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在MRS培养基上菌落形态有明显差异，保加利亚乳杆菌菌落较大且边缘不整齐、嗜热链球菌菌落较小且边缘整齐，两种菌落形态差异在培养48 h时比培养24 h时明显，见彩版Ⅱ。

表4 三种发酵剂在不同培养基上的生长情况Table4 Three kinds of culture in different media on the growth situation （lg cfu·mL-1）

2.4 青春双歧杆菌凝固型酸奶中青春双歧杆菌的计数结果

通过上述试验发现LM-MRS培养基对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌有明显的抑制作用，因此选择LM-MRS培养基对青春双歧杆菌凝固型酸奶中青春双歧杆菌进行菌落计数，并且在平板上随机挑取20个菌落镜检验证。青春双歧杆菌凝固型酸奶中青春双歧杆菌活菌数为2.0×106cfu·mL-1。

2.5 青春双歧杆菌凝固型酸奶中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的计数结果

利用MRS培养基对青春双歧杆菌凝固型酸奶进行菌落计数，大菌落且边缘不整齐为保加利亚乳杆菌、小菌落且边缘整齐为嗜热链球菌，并且在平板上随机挑取20个大菌落和20个小菌落镜检验证。青春双歧杆菌凝固型酸奶中保加利亚乳杆菌活菌数为8.0×108cfu·mL-1，嗜热链球菌活菌数为8.5×108cfu·mL-1（见彩版Ⅱ）。

3 讨论

本研究通过对几种选择培养基的比较发现，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和青春双歧杆菌均可在MRS培养基和XGal-MRS培养基上生长，活菌数无明显差别，并且三种乳酸菌在XGal-MRS培养基均形成蓝色菌落，无法使用XGal-MRS培养基从菌落颜色上区分三种乳酸菌，原因是由于三种乳酸菌的α-半乳糖苷酶均可分解XGal-MRS培养基中的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖，释放出吲哚产生蓝色菌落；Bile-MRS培养基对保加利亚乳杆菌有明显的抑制作用，对嗜热链球菌和青春双歧杆菌无抑制作用；LP-MRS培养基对青春双歧杆菌无抑制作用，对保加利亚乳杆菌有明显的抑制作用，对嗜热链球菌有一定的抑制作用，当嗜热链球菌浓度低时抑制作用明显，当嗜热链球菌浓度高时抑制作用减弱；LM-MRS培养基对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌有明显的抑制作用，对青春双歧杆菌无抑制作用。在保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和青春双歧杆菌同时存在的条件下，LM-MRS培养基是一种很好的青春双歧杆菌选择性培养基。当样品中同时含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，使用MRS培养基可以通过菌落形态来区分这两种乳酸菌，菌落大且边缘不整齐的为保加利亚乳杆菌、菌落小且边缘整齐的为嗜热链球菌。

4 结论

通过试验确定了青春双歧杆菌凝固型酸奶最佳工艺为白砂糖8%，接种量3%，保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌∶青春双歧杆菌=1∶1∶4，发酵4 h。结合MRS培养基和LM-MRS培养基可以对青春双歧杆菌凝固型酸奶中三种乳酸菌分别菌落计数，青春双歧杆菌凝固型酸奶中保加利亚乳杆菌活菌数为8.0×108cfu·mL-1，嗜热链球菌活菌数为8.5×108cfu·mL-1，青春双歧杆菌活菌数为2.0×106cfu·mL-1。

[1]汪芳安.乳酸菌发酵营养保健及其食品开发[J].西部粮油科技,1995(3):36-37.

[2]张延利,唐秀敏.酸奶的营养价值与保健功能[J].食品科技,1997(4):38-40.

[3]郭本恒.功能性乳制品[M].北京:中国轻工业出版社,2001:56-63.

[4]Salwa A A.Carrot yoghurt:Sensory,chemical,microbiological properties and consumer acceptance[J].Pakistan Journal of Nutrition,2004,3(6):322-330.

[5]Rial D R.The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health[J].Nutrition,2000,130:396-402.

[6]Brady L J,Gallher D D,Busta F F.The role of probiotic cultures in prevention of colon cancer[J].Nutrition,2000,130:410-414.

[7]Yusof R M,Haque F,Ismail M,et al.Isolation of Bifidobacteria infantis and its antagonistic activity against ETEC O157 and Salmonella typhimurium S-285 in weaning foods[J].Asia Pacific J Clin Nutr,2000,9(2):130-135.

[8]Annan N T,Borza A D,Hansen L T.Encapsulation in alginatecoated gelatin microspheres improves survival of the probiotic Bifidobacterium adolescentis 15703T during exposure to simulated gastro-intestinalconditions[J].Food Research International,2008,41:184-193.

[9]Lee H M,Lee Y.A differential medium for lactic acid-producing bacteria in a mixed culture[J].Applied Microbiology,2008,46:676-681.

[10]Vinderola C G,Reinheimer J A.Culture media for the enumeration of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus in the presence of yoghurt bacteria[J].International Dairy Journal,1999(9):497-505.

[11]Kneifel W,Toros A,Viernstein H.Differential enumeration of silage inoculants based on utilization of enzymatic activity and antibiotic sensitivity of bacteria[J].Journal of Applied Bacteriology,1994,77:42-48.

[12]Shah N P.Selective enumeration and survival in dairy foods[J].Journal of Dairy Science,2000,83(4):894-907.

[13]刘兰,曹郁生,黄筱萍.双歧杆菌选择计数方法的研究进展[J].食品与发酵工业,1999,4(25):61-63.

[14]Tabasco R,Paarup T,Janer C,et al.Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus,Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus,L.acidophilus,L.paracasei subsp.paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk[J].International Dairy Journal,2007,17(9):1107-1114.

[15]刘韩,关宏,杨文钦,等.青春双歧杆菌工业化培养基以及生长条件的筛选[J].东北农业大学学报,2010,41(9):112-116.

[16]权伍荣,王姝,李官浩.凝固型苹果汁酸奶的研制[J].食品科技,2009,34(3):102-106.