利用短小芽孢杆菌发酵马铃薯渣生产单细胞蛋白饲料的研究

张向东，杨 谦，余 佳，赵 磊，范金霞

（哈尔滨工业大学生命科学学院，哈尔滨 150001）

蛋白质资源短缺是全世界面临的重大难题，各国都很重视开发新型蛋白资源的研究。单细胞蛋白，是指非致病性真菌、酵母细菌等单细胞微生物体内所含蛋白质。含量高达细胞干重的45%～74%，且各种氨基酸搭配合理、种类齐全，维生素丰富等[1]。日益成为诸多科研工作者研究的重心[2-3]。单细胞蛋白的生产以食品工业废料[4-5]、农副产品下脚料及农作物纤维等为主要原料[6-7]，不仅来源广泛、生产成本低廉，而且对要求日益严格的环保问题，也体现着不可估量的价值[8]。我国千余家马铃薯淀粉厂每年产生的马铃薯薯渣与汁水超过340万t，薯渣与汁水中营养丰富含有大量的纤维素半纤维素，氨基酸、维生素、粗蛋白、微量元素等[9-10]，汁水的 COD（Chemical oxygen demand）在25000～30000之间。由于缺乏科学有效的处理技术，使淀粉生产过程中产生的薯渣和污水任意排放，造成严重的环境污染，产生不良的社会影响[11]。本研究以短小芽孢杆菌为发酵菌种，以马铃薯薯渣与汁水为原料，在不添加任何其他成分的情况下，初步获得了以马铃薯薯渣与汁水为原料生产单细胞蛋白的方法，所获得的发酵产物中精蛋白含量高，氨基酸组成均衡。在小鼠采食量与增重测试中均表现出优于同等质量豆粕。因此，本项工艺不仅解决环境污染的问题同时又生产了优质的单细胞蛋白，具有重要的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与大小鼠

短小芽胞杆菌（B.pumilus）ZY05是本实验室保存的菌种，Wistar大鼠、昆明白小鼠购自哈尔滨医科大学。

1.1.2 培养基

LB培养基:每1000mL中含有蛋白胨10 g；酵母提取物5 g；NaCl 10 g；pH 7.0，制作固体培养基时需加入20 g琼脂粉。

发酵培养基:马铃薯薯渣与汁水半固体培养基（大兴安岭丽雪精淀粉公司），依照生产实际比例混合。

1.2 方法

1.2.1 菌种制备

从斜面上挑取1环短小芽胞杆菌（B.pumilus）接种于LB液体培养基中，在37℃，150 r·min-1振荡培养12 h。菌液经离心以及去离子水清洗后，再用去离子水稀释至OD6001.0作为种子。

1.2.2 发酵产物中精蛋白含量的测定

应用双缩脲法测定精蛋白的含量[12]。

1.2.3 发酵产物中氨基酸组成的测定

应用全自动氨基酸分析仪测定发酵产物中氨基酸的组成[13]。

1.2.4 发酵产物中胰蛋白酶抑制因子含量的测定

胰蛋白酶抑制因子含量的测定具体见参考文献[14]。

1.2.5 发酵产物急性毒理试验

选用Wistar大鼠20只，雌雄各半，体重为180～220 g。采用最大耐受量试验方法，实验大鼠在本实验室适应环境3 d，禁食16 h后经口一次灌胃，样品用羧甲基纤维素做成混悬液灌胃，大鼠的灌胃容积为20mL·kg-1BW，灌胃剂量为10 g·kg-1BW。观察大鼠的中毒表现和死亡时间，观察时间为14 d。

1.2.6 鼠粮的制作

鼠粮配方如下表1所示。

表1 鼠粮配方Table1 Rat food formula (%)

鼠粮配置方法:首先配置不含有氮源的半成品鼠粮，根据试验的需要分别以同质量的薯渣、豆粕与短小芽孢杆菌的发酵产物作为氮源制作块状成品鼠粮。

1.2.7 发酵产物小鼠日采食量与增重的测定

取60只（雄雌各半）出生20 d小鼠，均分成3大组，每组20只雄雌各半，小鼠禁食水24 h后编号喂水喂食，通过超量投掷鼠粮、每4 d计算鼠粮减少量可知小鼠在单位时间内的采食量。同时测量小鼠体重增加量。

测得数据应用Excel 2003运算并绘图。

2 结果与分析

2.1 出发酵时间对精蛋白产量的影响

短小芽孢杆菌1%接菌量（体积比），在30℃，150 r·min-1振荡培养，从图1可知精蛋白在120 h出现高峰达到发酵后干物质总重量的17.81%。

2.2 发酵温度对精蛋白产量的影响

短小芽孢杆菌1%接菌量（体积比），分别于20、25、28、30、33、37、40 ℃培养，150 r·min-1振荡培养，发酵120 h测量精蛋白含量，从图2可知37℃发酵时发酵液中的精蛋白含量最高达到发酵后干物质含量18.8%。

图1 发酵时间对精蛋白产量的影响Fig.1 Influence of fermentation time on protein yield

图2 发酵温度对精蛋白产量的影响Fig.2 Influence of fermentation temperature on protein yield

2.3 发酵通气量对精蛋白产量的影响

短小芽孢杆菌1%接菌量（体积比），在37℃分别于90、120、150、180、210、240、300 r·min-1振荡培养，发酵120 h测量精蛋白含量，从图3可知，在振荡培养时转速在180 r·min-1时精蛋白产量最大达到发酵后干物质含量19.5%（见图3）。

2.4 接菌量对精蛋白产量的影响

短小芽孢杆菌分别以0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2.0%的接菌量（体积比），在37℃分别于180 r·min-1振荡培养，发酵120 h测量精蛋白含量，从图4可知，接菌量分别为0.8%、1%、1.5%、2.0%时单细胞蛋白含量区别很小（见图4）。

图3 发酵通气量对精蛋白产量的影响Fig.3 Influence of fermentation ventilation on protein yield

图4 接菌量对精蛋白产量的影响Fig.4 Influence of inoculation quantity on protein yield

2.5 发酵产物氨基酸组成分析

短小芽孢杆菌以0.8%的接菌量（体积比），在37℃，180 r·min-1下振荡培养，发酵120 h测量氨基酸组成，由表2可知，发酵产物氨基酸组成均衡全面。

表2 氨基酸组成分析Table2 Amino acid composition analysis （%）

2.6 胰蛋白酶抑制因子活性

胰蛋白酶抑制因子是主要抗营养因子，发酵后胰蛋白酶抑制因子活性降低68%（见图5）。提高了营养成分的吸收效率及适口性。

图5 发酵时间对胰蛋白酶抑制因子的影响Fig.5 Influence of fermentation time on TI

2.7 发酵产物的急性毒理试验

大鼠的急性毒性试验结果见表3，可知发酵产物不含有急性毒性成分。

2.8 小鼠平均采食量试验

小鼠的平均采食量见图6。由图6可知，小鼠对发酵产物的日采食量优于同等质量的豆粕，小鼠采食量的增加有利于小鼠吸收更多的营养。

2.9 小鼠平均增重试验

小鼠的平均增重见图7。由图7可知，食用薯渣发酵产物的小鼠平均增重优于食用同等质量豆粕的小鼠，平均增重是表现饲料品质的重要方面，薯渣发酵产物可替代豆粕作为饲料应用于动物饲养。

表3 大鼠急性毒性试验结果Table3 Rats acute toxicity tests results

图6 小鼠平均采食量Fig.6 Mice average intake

3 讨论

国内外利用马铃薯生产淀粉过程中，均产生大量的薯渣和汁水，马铃薯薯渣和汁水的主要成分是纤维素和蛋白质等。由于在生产淀粉过程中，需要添加一些化学物质，适口性差，因此产生的薯渣不能直接被畜禽利用，马铃薯薯渣不能直接作为动物饲料。而汁水COD高达25000～30000，马铃薯薯渣与汁水的处理一直是世界性的难题。马铃薯薯渣与汁水中含有丰富的营养物质能够通过微生物发酵获得单细胞蛋白，本研究优化了利用短小芽孢杆菌发酵马铃薯薯渣与汁水生产优质的单细胞蛋白的工艺，结果获得的发酵物中精蛋白含量达到19.23%，氨基酸全面均衡。

图7 小鼠平均增重Fig.7 Mice average weight gain

抗营养因子[15]破坏营养成分，阻碍营养成分的消化吸收，抗营养因子还直接影响饲料的适口性，严重影响蛋白饲料的品质。胰蛋白酶抑制因子是最主要的抗营养因子，薯渣与汁水发酵后胰蛋白酶抑制因子活性降低68%，小鼠在以薯渣为氮源的鼠粮中平均日采食量为2.04 g，在以豆粕为氮源的鼠粮中平均日采食量为2.74 g，在以短小芽孢杆菌发酵产物为氮源的鼠粮中平均日采食量为2.93 g；在小鼠采食量方面发酵产物优于豆粕，采食量在一定程度上反应了饲料的适口性，能够增加小鼠的采食欲望。通过小鼠的饲养试验可知小鼠在以薯渣为氮源的鼠粮中平均增重为12.6 g，小鼠在以豆粕为氮源的鼠粮中平均增重为17.3 g，小鼠在以短小芽孢杆菌发酵产物为氮源的鼠粮中平均增重为20.9 g；通过小鼠采食量与增重试验可知薯渣与汁水的发酵产物优于同等质量的豆粕，能够替代传统的豆粕饲料。本工艺如能得到产业化应用将极大的改变我国饲料蛋白短缺的现状[16]。

通过大鼠急性毒理试验以及小鼠的28 d饲养试验可知发酵产物产物安全无毒，作为蛋白饲料可以放心使用，在解决环境污染问题的同时实现了资源的综合利用。

4 结论

a.通过短小芽孢杆菌对马铃薯薯渣与汁水的发酵条件的单因子分析可知最佳发酵条件即0.8%的接菌量（体积比），37℃于180 r·min-1振荡培养，发酵120 h。

b.通过对发酵产物精蛋白质含量以及氨基酸组成分析，马铃薯薯渣与汁水发酵后精蛋白含量达到干物质含量的19.23%，氨基酸组成全面，具有作为蛋白饲料的潜力。

c.发酵产物通过大鼠急性毒理试验与小鼠28 d饲养试验证明无毒无害。

d.通过小鼠采食量与增重试验可知所获得发酵产物优于同等质量的豆粕，获得的高品质单细胞蛋白实现了废弃物的资源化，能够替代豆粕，具有良好的应用前景。

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