超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白研究
2011-03-07王喜波迟玉杰
王喜波,迟玉杰,2*,胥 伟
(1.东北农业大学食品学院,哈尔滨 150030;2.大豆生物学教育部重点实验室,哈尔滨 150030)
超声处理技术在食品加工领域已有应用,如食品体系的乳化、杀菌、破碎、萃取功能成分、干燥、检测等[1-5]。近几年来,随着各种不同型号超声设备的研制和完善,超声处理技术已渐成为食品工业中研究与开发的重点新型技术之一[6]。利用超声技术处理乳清蛋白的研究报道较多[7-9],如改善和提高乳清蛋白的溶解性、起泡性等,但是关于超声辅助琥珀酰化处理大豆蛋白以提高其功能性质的影响研究很少。
大豆蛋白具有较高的营养价值和重要的功能性质[10-13],因而在食品工业中有广泛的应用。但是天然大豆蛋白的功能性质较差,无法满足食品加工的需求,必须对其进行适度的改性[14-15]。蛋白质改性的方法很多,如物理、化学、生物酶等方法[16-18],目前这些改性方法多数处于研究阶段,较少用于实际生产。酰化改性是提高大豆蛋白功能性质的有效化学改性方法[19-20],改性产物的溶解性、乳化性都有一定程度的增加[21],但采用超声辅助酰化改性技术提高大豆蛋白功能性质鲜有报道。
本文将物理改性与化学改性技术相结合,利用超声技术辅助琥珀酰化改性大豆蛋白新工艺,研究优化改性条件、建立影响大豆蛋白乳化性因素间数学模型、探索改性前后蛋白分子特点变化,为建立适宜生产推广的高乳化型大豆蛋白改性新技术提供技术和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂
大豆蛋白(蛋白含量85%):哈高科大豆食品有限责任公司;大豆油:北海粮油工业(天津)有限公司;琥珀酸酐:国药集团化学试剂有限公司;十二烷基磺酸钠(SDS)为化学纯;其他试剂为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
喷雾干燥机(BüChi Spray Dryer(瑞士));2501 PC紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);FS-1可调高速匀浆机(金坛市荣华仪器制造有限公司);LD4-2A型离心机(北京医用离心机厂);JY92-2D超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);F-4500荧光分光光度计(日立公司)。
1.2 方法
1.2.1 普通琥珀酰化改性大豆蛋白工艺
将大豆蛋白(Soybean proteins,SP)溶于蒸馏水中按试验设计配成一定浓度,调整溶液pH 8.0,将琥珀酸酐(Succinic anhydride,SCA)试剂三等分,分别间隔5 min加入蛋白溶液中,反应一定时间,反应过程用2 mol·L-1NaOH维持反应体系的pH在8.0~8.5范围,反应结束后,溶液pH调至4.0,搅拌 30 min,4000 r·min-1离心 15 min,弃上清液,沉淀部分重复离心水洗2次,调pH至7.0,冷冻干燥即得普通改性产物。
1.2.2 超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白
将大豆蛋白溶于蒸馏水中按试验设计配成一定浓度,取60mL于烧杯中,置于探头式超声处理器中,按试验设计设定工作时间、间歇时间、处理功率参数,处理温度控制在20~30℃,处理结束后,按普通琥珀酰化改性步骤执行。
1.2.3 乳化性测定
将0.2%(W/V)的大豆蛋白样品溶解于磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0,0.1 mol·L-1)中,取30mL溶液加入10mL大豆油,于10000 r·min-1均质1 min,分别在均质后的0、10 min时从底部吸取100μL样品,用10mL,0.1%(W/V)的SDS稀释后在500nm(OD500)下测定吸光值,乳化活性用乳化活性指数(EAI)表示,即0 min时的吸光值,乳化稳定性用乳化稳定指数(ESI)表示[22]:
式中,A0-0 min时的吸光值;ΔT-时间差,10 min;ΔA-ΔT内的吸光值差。
1.2.4 SDS-PAGE电泳分析
采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[23]分析大豆蛋白改性前后的组成和结构的变化。
1.2.4.1 样品处理
精确称取0.01 g的样品,溶于10mL去离子水中,在4000 r·min-1离心20 min,取上清液10μL加入10μL溶解液中,在沸水浴中加热3 min。
1.2.4.2 灌胶和电泳过程
使用夹心式垂直板状电泳槽,玻璃板参数为20 cm×20 cm,使用的浓缩胶浓度为4%、分离胶浓度为12%,凝胶厚度1 mm,上样量为10μL。电泳初始时电流30ma,待蛋白样品进入分离胶时电流增到40ma;当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶板底部时,电泳结束。
1.2.4.3 染色与脱色
剥离凝胶,加入甲醇-乙酸固定液(甲醇∶水∶乙酸=5∶5∶1,V/V)固定过夜。取出固定好的凝胶在染色液(含0.05%考马斯亮蓝R250的固定液)中染色1~2 h,弃去染色液,加入脱色液(甲醇∶冰乙酸∶水=2∶2∶9,V/V),经常更换脱色液,直至凝胶的蓝色背景褪除,蛋白条带清晰为止。在凝胶置于凝胶成像系统中分析。
1.2.5 荧光光谱分析
样品溶于磷酸盐缓冲溶液(0.1 mol·L-1、pH 7.0)中,配制1%蛋白液,装入1 cm石英比色皿,置于F-4500荧光分光光度计中测量,激发狭缝和发射的狭缝均为5.0nm,激发波长为280nm,发射波长的范围为300~420nm。
2 结果与分析
2.1 超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白工艺优化
结果见表1,2。
本文在预实验结果基础上,以乳化活性为考核指标,应用响应面研究法(Response surface methodology,RSM)对影响改性产物EAI的大豆蛋白浓度、琥珀酸酐浓度、反应温度、超声处理功率、处理时间等5个因素进行优化,设计了Boxbehnken试验方案,建立数学模型。Box-behnken试验因素水平编码表见表1,Box-behnken试验方案和结果见表2。
表1 Box-behnken试验因素水平编码Table1 Factors and levels of Box-behnken experiment design
表2 Box-behnken试验条件及结果Table2 Box-behnken design and results of experiment
利用Design-Expert 7.1软件对表2的试验结果进行二次回归拟合分析,得到超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白的乳化活性Y的回归方程模型为:
对Box-behnken试验结果进行方差分析,分析结果见表3。由表3的方差分析结果可知,所得回归方程模型极显著(P<0.01),并且模型的失拟项检验不显著(P>0.05),说明用方程Y能够很好拟合真实响应面并反映出乳化活性与5个单因素之间的关系,可以利用此模型对超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白的反应过程进行预测和分析。根据表3的方差分析对Box-behnken模型方程进行优化,剔除影响不显著项(P<0.05),得到优化后的回归模型为:
表3 Box-behnken试验方差分析Table3 Variance analysis of Box-behnken design test
为了形象直观的表示各个因素对改性产物乳化活性的影响,根据模型绘制出因素间响应面图,揭示因素间的交互作用对产物乳化活性的影响,结果如图1所示。
由图1-a、1-b、1-c、1-d可知,大豆蛋白浓度对改性产物EAI的影响曲线较平缓,最佳反应条件集中在中心区,模型分析也表明蛋白浓度对改性产物的EAI影响不显著(P>0.05)。
图1 影响乳化活性因素的响应面分析Fig.1 Effects of variables on EAI with response surface analysis
由图1-a、1-e、1-f、1-g可以看出,改性产物的EAI随着琥珀酸酐浓度增加而呈上升趋势,但当琥珀酸酐浓度超过11%时,改性产物的EAI增加趋势不明显,表明此时大豆蛋白能发生酰化反应的活性基团已经反应完全,模型分析表明琥珀酸酐浓度对产物EAI影响极显著(P<0.01);由图1-b、图1-e、图1-h、图1-i能看出,反应温度对产物EAI影响显著(P<0.05),反应温度在50℃左右,改性产物EAI达到最高,高于或者低于此温度,EAI均下降;从图1-c、图1-f、图1-h、图1-j和模型方差分析中反映出,超声处理功率对产物EAI的影响极显著(P<0.01),在600 W左右产物EAI达到最高值,表明超声处理可以使大豆蛋白较紧密的结构舒展开[23],功率太高可能破坏已经形成蛋白聚集体使产物EAI降低,而处理功率不足时,蛋白紧密的球状结构不能充分伸展,疏水基团不能充分暴露,因而产物EAI也不高;从图1-d、图1-g、图1-i、图1-j可知,超声处理时间对产物EAI的影响,当处理时间为8 min左右时,产物EAI达到最高值,再继续增加处理时间则产物EAI有下降趋势。
2.2 验证试验
根据Box-behnken试验模型优化反应条件,得出超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白的制备条件为:大豆蛋白浓度7.1%,琥珀酸酐浓度12%,反应温度51℃,超声功率580 W,处理时间8 min,在此条件下模型EAI理论预测值(OD500)为0.825,实际测得值为0.819,实际值与预测值之间的相对误差在±1%以内,说明利用响应面分析法优化得到的工艺参数可靠准确,依据模型对改性产物EAI进行预测在实际试验中具有可行性。根据优化的工艺条件进行验证试验,并对比不同处理条件下个样品的乳化特性,如图2所示。
图2 改性产物与未改性样品EAI和ESI比较Fig.2 Comparison of EAI and ESI of modified and non-modified soybean proteins
结果表明,单一使用超声波处理或琥珀酰化可以使改性产物的乳化活性和稳定性明显提高(2号样品和3号样品),而超声辅助琥珀酰化改性产物的EAI和ESI(4号样品)要优于前两种单一方法,说明4号样品的EAI和ESI大幅提高是物理超声波作用和琥珀酰化化协同作用的结果,其EAI和ESI比空白样品分别提高了94.5%和268.9%,因此试验研究可为实现工业化生产高乳化型大豆蛋白产品提供理论和技术参考。
2.3 SDS-PAGE电泳分析
本文对改性前后的大豆蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,结果如图3所示。经超声改性的大豆蛋白的电泳谱带与未改性大豆蛋白的谱带几乎完全相同,说明超声作用只改变了大豆蛋白的高级结构,而对大豆蛋白的一、二级结构无明显影响,与Taylar等的研究结果一致[24],因此超声改性大豆蛋白乳化性的提高不是因为蛋白分子量降低造成的。经琥珀酰化和超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白的电泳迁移率略小于未改性的大豆蛋白,说明琥珀酸酐基团成功引入并使大豆蛋白分子发生了一定的聚集,从而使得大豆蛋白分子质量增大。而在谱带的构成上,与未改性的大豆蛋白相比变化不大,说明在改性的过程中大豆蛋白几乎不发生水解反应,乳化性的提高是酰化反应引入琥珀酸酐基团的作用。样品3和样品4的谱带颜色相对较浅,一方面是由于酰化改性使得大豆蛋白溶解性提高,在离心除盐时有少量大豆蛋白随上清液除去,另一方面是离心未除净的少量盐类物质使反应产物中的蛋白含量降低。
图3 改性前后大豆蛋白的SDS-PAGE电泳图谱Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of modified or unmodified SP
2.4 荧光光谱分析
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强,方法简便等优点,可用于研究溶液中的蛋白质的构象。在蛋白质分子中,能发射荧光的氨基酸只有Trp、Tyr、Phe,其荧光峰位(λmax)分别是348、303及282 nm,其中Trp的荧光强度最大,Phe的荧光强度最小。蛋白质荧光通常在280nm或更长的波长被激发,此条件下Phe基本不被激发,所以很少能观察到Phe的荧光发射,蛋白质的内源荧光主要来自Trp和Tyr残基。本试验将改性前后的样品进行荧光光谱比较分析,结果见图4。
图4 四种大豆蛋白样品的荧光发射图谱Fig.4 Fluorescence emission spectrums of four soybean proteins samples
大豆蛋白经改性后,荧光吸收强度均增加。Trp残基对微环境的变化很敏感,常被作为内源荧光探针来研究溶液状态蛋白质的构象,其λmax一般在325~350nm波长范围内波动[25]。由图4可知,不同改性方法对其荧光光谱影响程度有所不同,琥珀酰化和超声辅助琥珀酰化改性对的光谱的影响最大,荧光强度增加,说明Trp残基所处环境疏水性发生变化,反映出蛋白分子结构变化。天然大豆蛋白的结构为紧密的球状结构,亲水基团在外,疏水基团在内,呈色基团绝大部分位于分子内部,因此λmax处于较低水平,经过超声处理和琥珀酰化改性的大豆蛋白结构伸展,使内部的呈色基团暴露出来,使Trp的发射波长红移。从图中可看出超声改性对。λmax值的影响较小,说明试验条件下的超声处理对大豆蛋白的呈色基团所处的环境影响较小,即对疏水核心破坏较小。琥珀酰化和超声辅助琥珀酰化改性对λmax值的影响较大,说明两种改性方法使得大豆蛋白的结构更加舒展,但两种大豆蛋白荧光曲线几近重合,说明两种改性方法对大豆蛋白空间结构的影响及对疏水核心的破坏程度相近。
3 讨论
大豆蛋白的改性研究一直是食品研究热点之一,寻求技术可行、效果良好、安全性高的改性方法是本领域的研究重点。超声波技术在食品加工中用来提高生产效率和产品质量,取得了令人满意的结果,经超声处理的乳清蛋白,其起泡性等功能特性明显提高[7-9],大豆蛋白的表面性质也有提高[21]。本文的预实验结果表明探头式超声波处理器对大豆蛋白改性效果好于槽式处理器,与已有报道相符[26]。琥珀酰化改性大豆蛋白在提高蛋白溶解性、乳化性等方面具有明显效果[19-21]。但是单一的物理或化学改性,大豆蛋白的乳化特性提高幅度有限或者受到制备条件制约,将超声技术与琥珀酰化改性相结合进一步提高改性蛋白的乳化特性是本文的研究重点,结果表明,采用超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白的乳化特性优于单一方法[19-20,23],具有较好的发展潜力。目前的研究趋势表明,复合改性技术成为蛋白改性领域的研究热点和重点,因为复合改性具有效果明显、安全性高、成本较低等优点。
4 结论
a.超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白的乳化性质优于单一的超声改性或琥珀酰化改性方法,说明超声辅助琥珀酰化改性技术是超声的物理作用和琥珀酰化的化学作用协同作用的结果,是提高大豆蛋白乳化性质的有效方法。
b.SDS-PAGE电泳、荧光光谱分析结果表明,超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白产物结构发生较复杂的变化,更有利于乳化体系的形成和稳定。
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