乳腺癌淋巴管密度与血管内皮生长因子C相关性分析

许丙辉 薛亚静 李恒力 邢宏利 杜桂梅 王树峰

根据我国部分大城市的调查报告，乳腺癌已占女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌发生早期转移的途径，主要通过淋巴系统;探讨乳腺癌淋巴途径转移的相关因素，对于有效遏制其远位转移、判断预后和选择合适的治疗方案，均具有重要临床意义。近年来有学者研究指出，器官组织内淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)，可能与肿瘤的发生和发展密切相关［1，2］。而血管内皮生长因子 C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)是研究较多的特异性促淋巴管生成因子，在多种肿瘤淋巴管生成和淋巴结转中发挥重要作用。本研究通过测定乳腺癌组织内LVD及VEGF-C的表达情况，结合手术中观察腋窝淋巴结的癌转移情况，探讨乳腺癌组织的LVD、VEGF-C与癌转移和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 5例正常乳腺组织标本和5例乳腺纤维腺瘤标本均选自哈励逊国际和平医院外科门诊手术室;40例乳腺癌组织标本选自该院2006年1月至2009年1月乳腺癌手术切除标本，均经过病理学检查，证实为原发性乳腺癌。均为女性，年龄23～76岁，平均年龄49.50岁。所选乳腺癌病例，术前均未进行放疗或化疗，也未做过肿瘤活检术或腋窝淋巴结活检术，且都是行乳腺癌改良根治术切除的标本。其中非浸润癌组织标本9例，浸润性癌31例;腋窝淋巴结癌转移17例，无淋巴结癌转移23例。

1.2 LVD表达测定

1.2.1 取材:迅速将手术切除的乳腺组织标本剖开，切取肿瘤周边组织(含部分肿瘤组织)1 cm×1 cm小块，每例取6块，迅速放入已准备好的液氮罐中，尽快送至实验室，将组织块作好标记，置于低温冰箱中保存备用。

1.2.2 切片与染色:组织标本自液氮取出后，于Leika-1850型恒冷切片机的冷冻室中平衡5 min，进行连续切片，片厚5 μm，贴于防脱片处理的载玻片上。用4%多聚甲醛溶液固定15～20 min，蒸馏水清洗5 min，共3次。然后加5-核甘酸酶染色反应液，37℃条件下孵育1 h。蒸馏水清洗5 min，共3次。再用1%硫化氨显色，显色时间根据组织而定;蒸馏水清洗5 min，共3次。再向切片加碱性磷酸酶染色反应液，4℃条件下孵育1 h。蒸馏水清洗5 min，共3次。梯度浓度乙醇脱水(80%开始)，二甲苯透明2次后封片。

所有组织标本，均取相临切片做HE染色。酶组织化学染色主要试剂，5’-核甘酸酶(5’-nucleotidase，5’-Nase)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)组织化学反应试剂，均为Sigma公司产品。酶组织化学染液的配制和染色程序，参照曹雷等［3］研究报道。

1.2.3 结果判定:乳腺组织切片经5-Nase和ALP双重组织化学染色后，淋巴管内皮由于有硫酸铅反应产物的沉积，淋巴管呈现棕褐色。首先，在低倍(×40)显微镜下，观察全切片内的淋巴管分布后，选择淋巴管分布最为密集的六个区域;然后，在高倍(×100)显微镜下，观察在热点区每个视野下淋巴管的数目，取其均数作为该组织标本的LVD。

1.3 VEGF-C表达测定

1.3.1 试剂与方法:兔抗人VEGF-C多克隆抗体购自Santa Cruz公司。免疫组化染色SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，留取上述病例标本，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，按试剂盒说明(SP法)进行操作。

1.3.2 结果判定:标准根据SHIMIZU法［4］改良而成，显微镜下细胞质显示棕黄色颗粒视为阳性着色。结合着色范围和染色强度进行半定量处理，在显微镜下(×200倍)随机选取5个视野，以阳性染色细胞占视野中所有细胞的百分比均值作为着色范围。着色范围积分:≤1%为0分，2%～20%为1分，21%～5%为2分，≥51%为3分。着色强度积分:无着色为0分，浅着色为2分，深着色为2分。上述两项积分表达强度积分，1.9为阴性(-)，2～2.9为弱阳性(+)，3～3.9为阳性(2+)，≥4为强阳性(3+)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以¯x±s表示，计数资料采用χ2检验，采用Spearman法进行相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LVD结果 酶组织化学双重染色组织切片的光镜观察显示，在乳腺癌组织的内部及其周边部位，丰富的淋巴管呈现新生现象;淋巴管内皮呈现5’-Nase强阳性棕褐色反应，淋巴管的管壁较薄，管腔较大而且不规则;在同一张组织切片上，血管尤其是动脉血管内皮，呈现ALP强阳性蓝色反应，血管的管腔较小多为圆形(图1)。在正常乳腺组织和乳腺纤维瘤组织内，脉管样结构则相对较少。对乳腺组织内LVD的检测和分析表明，正常乳腺组织的LVD值为12.4±0.5，乳腺纤维瘤组织的LVD值为12.5±0.5，乳腺癌组织内的LVD值为16.1±1.5;其中，腋窝淋巴结癌转移组乳腺癌组织的LVD值为17.7±0.5，无腋窝淋巴结癌转移组的LVD值为14.9±0.5;二者比较差异有统计学意义(t=18.20，P=0.0001);腋窝淋巴结癌转移组的LVD值，明显高于无腋窝淋巴结癌转移组。乳腺癌组织中的LVD值，明显高于正常乳腺组织和乳腺纤维瘤组织的LVD值，二者比较差异有统计学意义(t=11.47，P=0.0001)。

图1 乳腺癌组织切片的酶组织化学双重染色，同时显示血管和淋巴管(HE×100)

2.2 VEGF-C结果 VEGF-C在乳腺组织中的表达VEGF-C主要表达于乳腺癌细胞胞质中，呈现淡黄色或棕黄色颗粒，细胞膜及细胞核未见染色。40例可见乳腺癌组织中33例可见VEGF-C表达阳性，对照组仅1例可见胞质少量淡黄色颗粒。乳腺癌组织VEGF-C表达的阳性率(82.5%)明显高于对照组(10.0%)，且差异有统计学意义(P＜0.05)。乳腺癌淋巴结转移组VEGF-C表达阳性率(82.5%)明显高于淋巴结无转移组(50.3%)，且差异有统计学意义(P＜0.05)。乳腺癌组VEGF-C表达程度积分值(2.94±1.43)明显高于对照组(0.24±0.6)，差异有统计学意义(P＜0.01)。乳腺癌淋巴结转移组VEGF-C表达程度积分值(3.26±1.30)高于淋巴结无转移组(2.01±1.46)，差异有统计学意义(P＜0.01)。VEGFC表达与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(r=0.352，P＜0.01)。2.3 相关性 LVD与VEGF-C表达呈正相关关系(r=0.786，P＜0.01)。

3 讨论

VEGF-C是血管内皮生长因子家族的一员，是人类发现的第一种促淋巴管生长因子。研究认为肿瘤细胞分泌出VEGFC，经丝氨酸蛋白纤溶酶等蛋白酶作用水解，形成VEGF-C的活性形式，VEGF-C与VEGFR-3结合后迅速被磷酸化，诱导下游的信号传导，例如激活VEGFR-3引起She磷酸化和ERK1及ERK2的活化，引起淋巴管内皮细胞增生，从而使淋巴管增生或扩张，加大肿瘤淋巴道转移的机会。

有学者研究发现，组织内淋巴管的新生在肿瘤细胞的扩散或转移的过程中较其他因素更为重要［5，6］。肿瘤组织内淋巴管的数量或密度与癌细胞的淋巴转移率呈正相关。本实验结果与这些报道或认识相一致。因此，乳腺癌组织中的LVD，可以作为预测腋窝淋巴结癌细胞转移的重要指标之一。

本实验研究所采用5’-Nase和ALP酶组织化学双染方法，在同一组织切片显示血管和淋巴管，主要是基于血管和淋巴管的内皮细胞，两种酶的含量存在差异，特异性不强且容易受到各种因素的影响。研究表明，利用血管和淋巴管内皮存在不同的细胞因子之特点，开发针对血管和淋巴管内皮细胞因子的特异性抗体，结合应用免疫组织化学染色技术，探讨正常和癌组织内脉管系的分布和LVD，并结合VEGF-C的表达研究，可能提供更为可靠的形态学证据［7］。

1 Achen MG，McColl BK，Stacker SA.Focus on lymphangiogenesis in tumor metastasis.Cancer Cell，2005，7:121-127.

2 Sleeman JP，Krishnan J，Kirkin V，et al.Markers for the lymphatic endothelium:In search of the Holy Grail.Microscopy Research and Technique，2001，55:61-69.

3 曹雷，王保芝，崔慧先，等.小鼠胰腺淋巴管的分布及其与胰岛的关系.中国解剖学杂志，2006，29:184-187.

4 Shimizu M，Saitoh Y，Itoh H，et al.Immunohistochemical staiming of ha-ras oncogene produet in normal，benign，and maligant human pancreatic tissues.Human Pathol，1990，21:607-612.

5 Al-Rawi MA，Mansel RE，Jiang WG.Molecular and cellular mechanisms of lymphaniogenesis.The Journal of Cancer Surgery，2005，31:117-121.

6 Tammela T，Enholm B，Alitalo K.The biology of vascular endothelial growth factors.Cardiovascular Research，2005，65:550-563.

7 Kato S.Organ specificity of the structural organization and fine distribution of lymphatic capillary networks:Histochemical study.Histology and Histopathology，2000，15:185-197.