脐血管上血红素氧合酶1的表达和活性与窒息新生儿的相关性研究

谢娟 张静 程艳蕊 戎小平 张晓莉 安晓燕

充足的子宫胎盘血流灌注是胎儿健康发育的前提，己有资料证实血红素氧合酶-1(HO-1)能增加子宫胎盘的血流灌注，加速血管生成，保护胎盘组织细胞。但是目前国内外对HO-1的研究多集中在成人疾病方面或动物实验阶段，尚未见到其与新生儿窒息发病相关性的研究报道。本研究旨在通过检测健康足月儿及窒息新生儿脐血中HO-1的活性，并观察HO-1在脐血管上的表达。研究探讨新生儿脐血管上HO-1的表达与窒息的关系，以期进一步阐明HO-1与新生儿窒息发病的关系及相关机制，为新生儿窒息的病因学防治开辟新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集石家庄市第四医院产科2008年1月至2009年10月正常分娩或剖宫产的新生儿60例，健康足月适于胎龄儿15例为对照组(A组)，窒息组分为轻度窒息组(B组) 30例和重度窒息组(C组)15例。其中男35例，女25例;胎龄37～42周。新生儿窒息的诊断标准参照第6版儿科学(人民卫生出版社出版)。所有新生儿均为适于胎龄儿，无宫内感染及先天畸形。母亲年龄≥24岁并≤36岁，无子宫畸形及心脏病、均无吸烟史及被动吸烟史。妊娠期间无特殊用药史。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与制备:新生儿娩出断脐后，立即用一次性无菌注射器从脐带近胎儿端抽取脐静脉血2 ml，注入洁净的干燥试管中，待自然凝固后，以3 000 r/min离心10 min，提取血清，分装入EP管中，置-80℃低温冰箱中保存，用于脐血血清HO-1活性的测定;所有病例于胎盘娩出或剖出后10 min内，取近胎儿处脐带约3 cm，用10%中性甲醛溶液固定，待脱水、石蜡包埋后用于HO-1免疫组化染色。

1.2.2 免疫组化测定:脐带组织采用(SP)法进行免疫组化染色，石蜡标本切为5 μm厚度，每个石蜡标本预留一张切片行HE染色。HIF-1α为兔抗人多克隆抗体(购自武汉博士德公司)，HO-1山羊多克隆抗体(SC-1796)(购自美国Santa Cruz公司)。

1.2.3 血清HO-1活性测定原理:参照王虹等［1，2］，提供的血清HO的活性测定方法进行。其是依据血红素经HO-1催化降解生成胆红素和CO的原理，进行样品中胆红素生成量的测定以代表HO-1的活性。

1.2.4 结果判定:镜下细胞胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，每组随机选5个高倍视野进行判断，参照Ota等［3］组化评分标准，由两个观察者对切片进行盲式阅片，显微镜下随机选择5个视野，观察所选择的高倍镜视野中的阳性染色细胞，记录阳性染色细胞百分数(%)并记分。阴性:小于5%的细胞呈阳性或无着色，记0分;弱阳性:5%～10%的细胞呈阳性，记1分;阳性:11%～50%细胞呈阳性，记2分;强阳性:大于50%的细胞呈阳性，记3分。细胞着色强度则以阳性细胞呈现的染色(棕黄色)记分:无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性百分数记分和细胞染色记分相加为免疫组化积分。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，采用正态性检验和方差齐性分析，多个独立样本均数比较采用单因素方差分析，SNK-q法进行多个样本均数间的多重比较，方差不齐时采用秩和检验分析和Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脐血管上HO-1表达 窒息组均有HO-1不同程度的表达，主要定位于脐动、静脉血管平滑肌细胞的胞浆内，胞核内也有少量表达。B组［(3.2±0.7)分］和C组［(3.7±1.3)分］与A组［(2.1±0.8)分］比较HO-1表达强度高(P＜0.05);B组和C组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1～4。

2.2 脐血HO-1活性 B组及C组脐血HO-1活性均显著高于A组(P＜0.01)。而C组脐血HO-1活性测定值虽然高于B组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

图1 C组脐血管HO-1的蛋白表达(SP×100)

图2 C组脐血管HO-1蛋白表达(SP×400)

图3 A组脐血管HO-1蛋白表达(SP×100)

图4 A组脐血管HO-1蛋白表达(SP×400)

表1 3组脐血中HO-1活性比较 ±s

表1 3组脐血中HO-1活性比较 ±s

注:与A组比较，*P＜0.01

组别 HO-1 F值 P值A组(n=15)62±5 B组(n=30) 89±8* C组(n=15) 93±8*94.539 ＜0.01

3 讨论

新生儿窒息是指婴儿出生后无自主呼吸或呼吸抑制而导致低氧血症和混合性酸中毒。凡能使血氧浓度降低的任何因素都可以引起窒息，其本质是缺氧。新生儿窒息后可并发多脏器功能损害，如脑、心、肾、肝脏等损伤，国内发病率约为5%～10%，是引起新生儿死亡和儿童伤残的重要原因之一［4］。HO-1是催化血红素降解的起始酶和限速酶，已发现其在多种疾病中有异常表达。HO-1的内源性适量表达可以对机体起保护作用，因此本研究通过观察窒息新生儿脐血管上HO-1的表达，及对脐血HO-1活性的测定，在分子水平探讨HO-1在新生儿窒息中的作用。

HO-1及其产物CO、胆绿素和铁均有明确的抗氧自由基作用，已被大量研究证实［5］。血红素氧分酶(HO)是催化血红素降解的起始酶和限速酶，具有广泛的生物学功能，已发现有3种同工酶。其中HO-1亦称热应激蛋白32(HSP32)，是诱导型HO，分子量约32 000，它广泛分布于全身组织细胞的微粒体内，在缺氧时可诱导其大量表达。体内实验证实，在肝缺血再灌注过程中，随着肝组织中HO-1mRNA表达的增加，肝细胞的凋亡逐渐减少。HO-1mRNA的表达增加能通过抑制细胞凋亡，减少缺血再灌注时的细胞损伤［6］。多数研究结果表明，HO-1仅在急性缺氧时升高，随着缺氧时间的延长而逐渐降低，以至恢复。动物实验在低灌注及低代谢状态下，观察到缺血3周时HO-1的表达增加，6周时HO-1蛋白表达最明显，9周时逐渐下降，HO-1缺氧应激蛋白的基因表达，使内源性保护系统被激活，发挥代偿作用［7］。Lundby等［8］观察到，在高原地区(海拔4 100 m)居住2周和8周的健康志愿者，其肌肉组织中HO-1的表达无明显变化。在低氧条件下培养1～2周的人肺末梢动脉平滑肌细胞，HO-1表达也无明显变化［9］。这些结果均表明HO-1为急性应激反应蛋白。

本研究显示，窒息组脐血管上HO-1表达明显高于对照组，且脐血中HO-1活性测定亦高于对照组，由此推测缺氧状态下，HO-1蛋白及酶活性的增多，对窒息时机体起到保护作用。HO-1活性测定是通过其生成胆红素量来间接反应其活性的，因此推测在缺氧状态下HO-1通过其代谢产物发挥抗氧化作用，保护机体对缺氧耐受。这一结果与动物实验及成人相关研究相类似:内源性HO-1过度表达在应激情况下保护多种组织细胞，陈波等［10］通过实验证实HIF-1能够在转录水平上调节HO-1的表达，且在缺氧复氧损伤中起到显著抗调亡作用。HO-1的代谢产物CO是一种新型神经递质，现已证实有舒张血管，抑制血小板聚集作用。因此本实验表明HO-1与新生儿窒息发病密切相关，在缺氧情况下表达增高，其缺氧适应性调节机制可能对机体具有重要的保护作用。

1 王虹，李华强，潘捷.哮喘豚鼠血红素氧合酶1的表达与调节.中华结核与呼吸杂志，1999，22:605-609.

2 Yet SF，Pellacani A，Patterson C，et al.Induction of heme oxygenase-1 expression in vascular smooth muscle cell.A link to endotoxic shock.J Biol Chem，1997，272:4295-4301.

3 Ota H，Igarashi S，Sasaki M，et al.Distribution of cyclooxygenase-2 in eutopic and ectopic endo-metrium in endometriosis and adenomyosis. Hum Reprod，2001，16:561-566.

4 王翠娟.新生儿窒息的产科原因分析.河北医药，2010，32:1127.

5 Taille C，El-Benna J，Lanone S，et al.Induction of heme oxygenase-1 inhibits NAD(P)Hoxidase activity by down-regulating cy-tochrome b558 expression via the reduction of heme availability.J Biol Chem，2004，279:28681.

6 郭雅，宋经清，肝缺血再灌注后的表达及其与细胞凋亡关系的临床研究.中国现代医学杂志，2009，19:3259-3262.

7 魏爱宣，徐忠信.慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠皮层HIF-1α、HO-1表达的变化.中国老年学杂志，2010，4:913-914.

8 Lundby C，Pilegaard H，vanHall G，et al.Oxidative DNA damage and repair in skeletalmuscle of humans exposed to high-altitude hy-poxia. Toxicol，2003，192:229-236.

9 Yang X，Sheares KK，Davie N，et al.Hypoxic induction of cox-2 regulates proliferation ofhuman pulmonary rtery smoothmuscle cells.Am J Respir Cell Mol Biol，2002，27:688-696.

10 陈波，赵鸿，郑景存.缺氧诱导因子1在人肾微血管内皮细胞低温缺氧再复氧损伤中的抗凋亡作用.复旦学报(医学版)，2005，32: 687-698.