无菌体液标本中真菌分离率和耐药性分析

李中春 桓伟华

近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用以及各种侵入性诊疗技术的开展和一些严重疾病，如糖尿病、肿瘤、艾滋病等发病率的不断升高，条件致病性真菌感染日益增多。加强深部真菌感染的控制及耐药检测，有效防治深部真菌感染及提高治愈率已成为目前医学领域中的重要问题。为了解血行性真菌感染及其他无菌体液标本真菌的分布及耐药性，对本院临床无菌体液培养阳性的890份标本中，真菌的分离情况及耐药性进行分析，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本来源:2005年1月至2010年12月本院临床送检的无菌体液标本。同一患者相同标本多次分离出相同菌者，按1株菌计算;相同标本分离出2种或以上菌种，或自不同部位分离出相同或不同菌者，按2株或2种以上计算。

1.1.2 培养基:沙氏琼脂购自北京药品生物制品检定所，显色琼脂培养基为法国科玛嘉公司产品。

1.1.3 试剂:菌种鉴定及药敏试验用珠海迪尔生物工程有限公司DL-96FUNGUS试剂板，包括5-氟胞嘧啶(5FC)、两性霉素B(AMB)、制霉菌素(NYS)、咪康唑(MIC)、益康唑(ECO)、酮康唑(KET)。

1.1.4 仪器:山东鑫科LABSTAR2000血培养仪。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离:按操作规程［1］，依不同标本，经增菌(血液、脑脊液、胸腹水等)转种或直接划种沙氏琼脂(尿液)及显色琼脂，35℃孵箱培养、分离。

1.2.2 菌种鉴定及药敏试验:将酵母菌菌落划种于沙氏琼脂或显色琼脂上，经35℃培养，24～48 h后根据其颜色进行鉴定。将纯培养菌落，用珠海迪尔生物工程有限公司DL-96FUNGUS真菌试剂板配套稀释液制备成浓度为1McFarland的酵母菌悬液，吸取100μl菌悬液放到同化稀释液的安瓶中，小心混匀，用加样器吸100μl到C1-C11、D1-d1 2孔中，然后再加药敏稀释液100μl至E12孔，最后吸20μl稀释菌悬液至药敏稀释液中，充分混匀后分配到E1-E11、F2-F12孔中，每孔100μl，撕开不干胶的纸对齐贴于试剂板上，30℃湿盒内培养，24～48 h读取结果。质控菌株为ATCC60193白色念珠菌。

2 结果

2.1 感染部位分布 在培养阳性的890份无菌体液标本中，共分离出真菌69株(7.8%)8种。69株真菌主要来源于血液标本53株(76.8%)、尿液8株(11.6%)、引流液2株(2.9%)、关节腔液1株(1.4%)、脑脊液2株(2.9%)、胸腹水2株(2.9%)、囊液1株(1.4%)。

2.2 菌种年度分布情况 各年度无菌体液培养分离的真菌菌株数量有所不同，检出的真菌数量呈逐年上升趋势。见表1。

表1 2005年1月至2010年12月无菌体液培养分离真菌情况

2.3 临床无菌体液标本分离真菌的菌种分布 检出真菌数量最多的病区为重症监护病房(ICU)13株(18.8%)，脑外科9株(13.0%)，肿瘤科8株(11.6%)，泌尿外科7株(10.1%)，胸外科 6株(8.7%)，呼吸内科 6株(8.7%)，血液科 5株(7.2%)，老年病房4株(5.8%)，骨科3株(4.3%)，内分泌科2株(2.9%)，肾内科2(2.9%)其他科室共4株(5.8%)。见表2。

表2 69株真菌的菌种分布

2.4 药敏试验 药敏试验结果见表3。

表3 69株无菌体液标本真菌药敏试验结果

3 讨论

真菌是一种条件致病菌，可存在于正常人的皮肤和黏膜处，当机体抵抗力低下时可侵袭机体引起机会性感染。医源性因素可能是深部酵母样真菌感染的重要诱因:气管插管、导尿、血液和腹膜透析、介入治疗等侵入性诊疗操作、大型外科手术等医源性因素破坏了人体的天然屏障。我们分离的69株标本中，15%来自脑外科，以昏迷患者和深部组织创伤患者真菌感染比较常见。15%来自肿瘤科，以肝癌、肺癌占大多数。住院日长、大剂量广谱抗菌药物的应用，导致菌群失调，是真菌感染的直接诱因。

文献报道，念珠菌血症死亡率高达45% ～75%［2］。真菌引起的医院感染率增多，感染的菌种不再局限于几种，针对不同的真菌其耐药性有所提高，白色念珠菌感染由原来的占绝对优势到逐渐下降到50%，而热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌的检出率大有提高，这与国内的报道基本一致［3］。不同的标本来源，酵母样真菌的构成比也有差异。在尿液标本中以热带念珠菌为主，白色念珠菌、光滑念珠菌次之，在其他的CVP管和无菌体液中，白色念珠菌、近平滑念珠菌分列前3位，但其他各种的酵母样真菌均有检出，占9%，菌种种类有近10种。

由于越来越多的广谱抗生素的使用，使临床上耐药真菌逐渐增多，与文献报道相近［4］。我们分离的69株真菌中，白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌对5FC、AMB、NYS较敏感，而MIC、ECO、KET耐药率稍高，克柔念珠菌对5FC耐药。不同种类的真菌耐药谱是相对稳定的，目前，临床较普遍使用的抗真菌药物是氟康唑，对白色念珠菌、热带念珠菌及近平滑念珠菌耐药率已经达到40.1%［5］，可能因为氟康唑对光滑念珠菌、克柔念珠菌存在天然耐药现象有关。

真菌感染是一种难治性疾病，病死率很高。在临床工作中针对真菌感染应该做到积极预防，早期发现，及时进行真菌培养和药敏试验，指导临床合理使用抗真菌药物，以提高治愈率，降低病死率［6］。

1 卫生部医政司主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京:东南大学出版社，2006.736-753.

2 李若瑜，王瑞礼.密切结合临床提高真菌学检验水平.中华检验医学杂志，2003，26:521-523.

3 陶风蓉，宣天芝，张秀珍.用E-test方法监测酵母样真菌对氟康唑的耐药性.中华医院感染学杂志，2002，12:632-633.

4 李伟，李若瑜.深部真菌感染的实验室诊断和药敏试验.中国感染与化疗杂志，2007，7:289-292.

5 姚正国，黄宪章，范秋莲，等.酵母菌对氟康唑的药物敏感实验分析.中华医院感染学杂志，2004，14:44.

6 吴建华，沈洁，王英，等.院内患者深部真菌感染的流行病学调查.中国真菌学杂志，2006，1:337-339.