荧光分光光度法检测维库溴胺的血药浓度

赵 丽，郭越洁，张勤功，赵真英

(1.山西省肿瘤医院麻醉科，山西 太原 030013; 2.山西医科大学，山西 太原 030001)

维库溴胺是一种中短效非去极化肌松药，主要优点是恢复速率快和无心血管副作用[1]，目前已成为临床麻醉中最常用的非去极化肌松药之一。测定维库溴胺的血药浓度，对于指导临床合理用药具有重要意义。为适应临床药物代谢动力学研究的需要，笔者建立了测定维库溴胺血药浓度的荧光分光光度法，现报道如下。

1 仪器与试药

美国瓦里安荧光分光光度计;GL－88 B型旋涡震荡器;高速冷冻离心机(北京医用离心机厂);微量加液器。维库溴胺标准品(浙江仙琚制药有限公司)，需当日配制;四氯四碘荧光素应用液(0.5 g/L)，使用前需纯化，当日配制;0.2 mmol/L碳酸缓冲液，pH为10.5;氯仿、丙酮等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 荧光分析条件选择

精密量取维库溴胺适量，置量瓶中，用水溶解并稀释成1 g/L的贮备液备用。精密量取维库溴胺贮备液置量瓶中，加水稀释成1μg/mL的溶液，置荧光分光光度计上扫描(激发、发射狭缝均为10 nm)激发光谱及发射光谱。结果见图1，最大激发波长为550.00 nm，最大发射波长为590.00 nm。

图1 维库溴胺的激发光谱和发射光谱

2.2 样品提取

取肝素抗凝全血，用高速冷冻离心机以4 000 r/min离心10 min，吸取上清血浆1 mL，保存在－20℃条件下，备用。

2.3 生化测定步骤

选用带塞塑料离心管，依次加入内含维库溴胺的标准液或血浆1 mL，碳酸氢钠缓冲液1 mL，荧光素工作液0.5 mL，氯仿7 mL，每加入1种试剂后均需要在液体混合器上充分混匀;将离心管放置在震荡器上震荡2 min;将离心管放置在高速冷冻离心机中，选择10 000 r/min，10℃ 条件离心10 min;离心完毕，吸弃上清水相，精确吸取有机相0.5 mL，置内含3.5 mL丙酮的带塞玻璃管，充分混匀后待测定。荧光测定选择激发/发射波长为550/590 nm，狭缝10 nm。

2.4 方法学考察

线性关系:取维库溴胺贮备液，精密配置成质量浓度分别为0.05，0.10，0.50，1.00，1.50，2.00 μg/mL 的溶液，以质量浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。维库溴胺质量浓度在0.05～2.00 μg/mL范围内与荧光强度呈线性关系。在水溶液中，测定的荧光强度与药物质量浓度之间的回归方程为 Y(荧光强度)=3.247+5.63 × 水中药物质量浓度(μg/mL)，r=0.997 6。在试管中分别加入1 mL空白血浆，再加入维库溴胺标准溶液，使血药浓度相当于 0.05，0.10，0.50，1.00，1.50，2.00 μg/mL，按 2.3 项下方法进行测定，血浆中荧光强度与药物质量浓度之间的回归方程为Y(荧光强度)=1.235+4.01 ×血药浓度(μg/mL)，r=0.995 8。

稳定性:配制维库溴胺血浆标本质量浓度为0.5 μg/mL，考察血浆样品在－20℃条件下，保存0，2，5，10 d及室温放置2 h的稳定性。结果见表1。

表1 血浆标本放置后质量浓度变化(n=6)

精密度:分别配制含维库溴胺的低、中、高3种质量浓度(0.1，1.0，2.0μg/mL)的血浆标本各6份，进行重复测定。结果见表2。

提取回收率:配制含不同质量浓度的维库溴胺标准血样，经萃取后测定其荧光强度，同法测定不经萃取的标准维库溴胺荧光强度，用经萃取后测定的荧光强度值除以不经萃取的标准维库溴胺的荧光强度乘以100%，计算提取回收率。结果见表2。

表2 人血浆中药物浓度测定精密度及回收率(n=6)

方法回收率:分别配制质量浓度为 0.10，1.00，2.00 μg/mL 的血浆样品，按2.3项下方法进行测定，将测定的维库溴胺荧光强度代入标准曲线，求出测定药物质量浓度，按测定量/添加量乘以100%计算方法回收率。结果见表2。

检测限:本方法能够测出的维库溴胺最低血药浓度为0.05 μg/mL，类似于文献[2－3]报道的结果。

3 讨论

本研究建立了检测血浆维库溴胺质量浓度的荧光分光光度法，专属性强，分离完全，操作简单，成本低廉。该法相对回收率大于96%，绝对回收率大于80%，日内、日间精密度 RSD均小于8%，符合生物等效性指导原则关于生物样品分析方法的基本要求，可用于人体药物代谢动力学和生物等效性试验的血药浓度检测。

试验中要注意温度的影响。由于维库溴胺在血浆中不太稳定，极易降解，所以血样应在－20℃以下冰箱储存，长期储存应放置在－70℃冰箱。在提取中应选用低温高速离心(10℃，10 000 r/min)，以减少药物的分解，提高试验的准确度。

所配制的荧光素贮备液于黑暗、4℃保存时相对较稳定，但含量也会逐渐下降，应在4 d内使用为宜。试验发现，贮备液所配制的应用液稳定性很差，故荧光素应用液应当日配制，即配即用。

由于荧光分光光度法对试剂纯度、实验用水和试管等玻璃器皿洁净度要求非常高，故所用玻璃器皿等均需经硝酸浸泡，且务必多次洗刷干净。

本试验结果表明，本法样品预处理过程简单，回收率高，线性范围宽，测定方法精密度高，重现性好，结果准确，适于临床和科研应用，可作为测定维库溴胺血药浓度的常规方法。

[1]LienCA.Rationaluseofmusculerelaxants[J].AnesthAnalg，1994，6:66－72.

[2]Kersten UW，Meijer DKF，Agoston S.Fluorimetric and chromatographic determination of pancuronium bromide and its metabolites in biological materials[J].Clini Chimi Acta，1973， 44(1):59－66.

[3]Rupp SM，Castagnoli KP，Fisher DM，et al.Pancuronium and vecuronium pharmacokinetics and pharmacodynamics in younger and elderly adults[J].Anesthesiology，1987，67(1):45－49.