高糖培养人肾小球系膜细胞对JAK2／STAT1信号蛋白活化的影响

陈红敏 李 竞 高 凌 洪 练

高糖培养人肾小球系膜细胞对JAK2／STAT1信号蛋白活化的影响

陈红敏 李 竞 高 凌 洪 练

本文2011—02—14收到，2011—03—02修回，2011—03—04接受

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病常见微血管病变，已成为导致慢性肾衰的主要原因，其发生发展机制尚未完全明确。近年来有研究提示，Janus激酶／信号转导子与转录激活子（Janus Activated Kinase-Signal Transducer and Activator of Trancriptions，JAK／STAT）信号通路与系膜细胞的增殖、肥大及细胞外基质（Extra-cellular Matrix，ECM）分泌有关，但具体机制尚未十分清楚。本研究通过观察高糖培养人肾小球系膜细胞（HMCs）对JAK2、STATl的激活，以及对转化生 长 因 子 β1（Transforming Growth Factorβ1，TGF-β1）和纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）mRNA表达和蛋白分泌的影响，探讨高糖如何通过HMCs的JAK2／STAT 1信号途径促进TGF-β1和FN的合成，从而加速肾脏纤维化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗人p-JAK2和p-STAT1单克隆抗体（购于美国 Cell Signaling Technology公司）、β-actin兔抗人多克隆抗体由美国Santa Cruz提供；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗，NC膜、RIPA裂解液、PMSF、凝胶试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、封闭液、一抗和二抗稀释液、ECL Plus化学发光试剂盒均购于碧云天公司；TGF-β1、FN、GAPDH 引物由上海生工合成。TGF-β1、FN ELISA试剂盒购于博士德公司。

1.2 HMCs培养和分组

HMCs购于中南大学湘雅医学院细胞库，保存于液氮中。复苏HMCs，于15%胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素）DMEM培养基中培养，在5%CO2、37℃恒温培养箱内孵育，待细胞生长至亚融合状态时，更换为无血清DMEM 低糖培养基（5.6mmol／L）使细胞同步化24 h，设为低糖对照组。然后换用30mmol／L的葡萄糖培养细胞，分别于6h、12h、24h、48h（分别为高糖培养6h组、12h组、24h组和48h组）提取蛋白、RNA和收集上清液，保存于—70℃。每次检测重复3次。

1.3 RT-PCR检测 TGF—β1、FN mRNA表达

用RNA提取试剂（Trizo1）提取 HMCs总RNA，用紫外可见分光光度仪测定其纯度和含量；于反转录酶（AMV）催化下合成c DNA后进行PCR扩增；TGF-β1上下游引物分别为：5’-GGT GGA AAC CCA CAAC GAA-3’和 3’-CTA AGG CGA AAG CCC TCA AT-5’，扩增片段为321 bp；FN上下游引物分别为：5’-TAG CCC TGT CCA GGA GTT CA-3’和 3’-CTG CAA GCC TTC AAT AGT CA-5’，扩增片段为346 bp；三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）上下游引物分别为：5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’和3’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-5’，扩增片段为452 bp。TGF-β1扩增条件为：94℃30 s，58℃30 s，72℃50 s，循环35次；FN 扩增条件为：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃50 s循环40次。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下凝胶成像系统成像，用UVI图像分析处理系统进行吸光度扫描，以目的基因片段／GAP-DH片段的条带灰度值比值来表示其相对含量。

1.4 ELISA 检测上清液中 TGF—βl、FN 蛋白含量

取HMCs培养的上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行TGF—βl、FN浓度测定。

1.5 Western blotting检测p-JAK2、p-STAT1蛋白的表达

（1）RIPA裂解液冰上裂解细胞，取上清；（2）BCA法测定上清蛋白浓度；（3）取细胞裂解蛋白50 μɡ，经8%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后电转移至硝酸纤维素膜（NC膜），封闭液封膜2h，加兔抗人 p-JAK2、p-STAT1抗体（1∶800稀释），4℃过夜，TBST洗膜后加 HRP标记的羊抗兔抗体（1∶5000稀释）孵育1h、TBST洗膜后加ECL试剂，将NC膜压片、显影、定影。用美国UVP公司abworks 4.5分析系统软件对电泳条带进行定量分析，测定杂交条带的吸光度（A）值。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 高糖培养HMCs不同时间对TGF-β1 mRNA表达的影响（图1、表1）

与低糖对照组比较，高糖各组TGF-β1 mRNA表达上调，除6h外，12h、24h、48h差异均有显著性意义（P＜0.01）；并随作用时间延长，其表达逐渐增加。

注：与低糖对照组比较，△P＜0.01图1 高糖培养HMCs不同时间对TGF-β1 mRNA的影响

2.2 高糖培养HMCs不同时间对FN mRNA表达的影响（表1、图2）

与低糖对照组比较，高糖各组FN m RNA表达上调，除6h和12h外，24h和48 h与其差异均有显著性意义（P＜0.01）。

表1 高糖培养HMCs不同时间对TGF—β1、FN mRNA的影响（灰度比值，±s，n＝3）

表1 高糖培养HMCs不同时间对TGF—β1、FN mRNA的影响（灰度比值，±s，n＝3）

注：与低糖对照组比较，1）P＜0.01

组 别 T G F-β 1 0.3 7±0.0 1 0.4 0±0.0 6培养6 h组 0.4 0±0.0 4 0.4 9±0.0 4培养1 2 h组 0.5 3±0.0 2 1） 0.5 1±0.0 3培养2 4 h组 0.6 4±0.0 2 1） 0.7 6±0.1 2 1）培养4 8 h组 0.6 7±0.0 1 1） 0.8 2±0.1 5 1）低糖对照组F N

图2 高糖培养HMCs不同时间对FN mRNA的影响

2.3 高糖培养HMCs不同时间对上清液中TGF-β1、FN蛋白含量的影响（表2）

与低糖对照组比较，高糖各组上清液中TGF-β1、FN含量增高，除6h和12h外，其余各组差异均具有显著性统计学意义（P＜0.01），随时间延长，其表达逐渐增加，48h达到高峰。其中，TGF-β1在24h和48h之间无显著性差异，而FN在24h和48h之间差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 高糖培养HMCs不同时间对TGF—β1、FN蛋白含量的影响（±s，n＝3）

表2 高糖培养HMCs不同时间对TGF—β1、FN蛋白含量的影响（±s，n＝3）

组 别 TGF-β1（pg／ml） FN（ng／ml）274.48±10.28 44.13±2.29培养6h组 284.07±13.06 47.98±4.81培养12h组 294.65±13.11 58.31±6.40培养24h组 316.07±27.201） 95.57±10.911）培养48h组 324.40±16.691） 166.74±16.351）2）低糖对照组

注：与低糖对照组比较，1）P＜0.01；与培养24h组相比，2）P＜0.01

2.4 高糖培养HMCs不同时间对p-JAK2蛋白表达的影响（图3）

与低糖对照组比较，高糖各组p-JAK2表达增高，24h时达到高峰，48h有所回落。

图3 高糖培养HMCs不同时间对p-JAK2蛋白的影响

2.5 高糖培养HMCs不同时间对p-STAT1蛋白表达的影响（图4）

与低糖对照组比较，高糖各组p-STAT1表达增高，并随着时间延长，其表达水平逐渐增加，48h达到高峰。

图4 高糖培养HMCs不同时间对p-STAT1蛋白的影响

3 讨 论

DN是糖尿病常见微血管病变，是导致慢性肾衰的主要病因之一。DN的发病机制尚不十分清楚，ECM的累积和肾脏纤维化是其主要病理改变［1］，而 细 胞 因 子 TGF-β1、结 缔 组 织 生 长 因 子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）等在ECM累积和肾脏纤维化过程中发挥着不可忽视的作用［2］。

TGF-β1是调节系膜细胞ECM积聚的重要细胞因子。一方面，TGF-β1可以刺激ECM蛋白成分（FN、胶原蛋白）的产生；另一方面，它能抑制蛋白酶的分泌，减少ECM蛋白的降解。在糖尿病患者和动物模型中，肾小球中TGF—β1 mRNA水平和基质成分较正常者显著增高，如肾小球基底膜增厚和系膜外基质的扩增［3］，高糖体外培养 HMCs，TGF-β1和FN表达显著增加［4］等。本实验结果显示：与低糖对照组比较，高糖培养人肾小球系膜细胞，TGF-β1、FN mRNA和蛋白水平显著增高，在培养48h左右达到高峰。高糖环境中系膜细胞TGF-β1和FN的合成增多，可能与高糖活化蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）的一个或多个亚型有关［5］。

JAK／STAT途径是近年来新发现的一条信号转导途径，可以发挥信号转导和基因转录活化子蛋白的双重作用，介导多种细胞因子和生长因子细胞内信号转导过程，并活化相应靶基因，从而发挥生物学效应。近年来研究发现JAK／STAT信号通路的激活可以刺激肾小球系膜细胞过度增殖和增生，导致DN［6］。在 DN 患者肾小球和肾小管中，JAK／STAT通路显著上调，其中JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT3的表达较正常患者明显增高［7］。在NRK-49F细胞中，糖基化终末产物可以促进JAK2的磷酸化，进而激活STAT1、STAT3；加入JAK2特异抑制剂AG-490，STAT1和STAT3的活性减低，胶原蛋白的合成减少，从而减少ECM累积［8］。Wang等［9］研究表明：高糖可激活肾小球系膜细胞JAK2、STAT1、STAT3、STAT5活性，但其可能是通过激活JAK2／STAT1信号蛋白刺激TGF-β1和FN合成，导致ECM的累积和肾脏纤维化，而非JAK2／STAT3、STAT5信号通路。本实验观察JAK2／STAT1信号蛋白途径在ECM聚集的作用，结果表明：高糖培养时，HMCs的JAK2、STAT1磷酸化蛋白水平较低糖对照组显著增加，并分别在高糖作用24h和48h达到较高水平。对JAK2的这种活化效果，有研究认为其可能与高糖促进活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的产生有关［10，11］。

JAK2／STAT1通路影响 TGF-β1合成的机制尚不十分清楚。有文献提示，JAK2／STAT1信号通路活化后可能通过促进核因子（c-jun、c-fos）基因的表达来增加TGF-β1和FN的合成［6］。jun、fos基因分别编码的Jun和Fos蛋白嵌合成二聚体复合物活化蛋白1（Activator Protein-1，AP-1），而 TGF-β受体的基因启动子含有AP-1的结合位点［12］。由此推测，HMCs经高糖促进ROS的合成而激活JAK2／STAT1通路，进而促进相关核转录因子（如AP-1）活化、TGF-β1基因转录等一系列变化，最终引起ECM的大量聚集，加速肾脏纤维化。

综上，高糖作用下 HMCs中 TGF-β1、FN mR-NA和蛋白水平的升高与JAK2／STAT1磷酸化密切相关。更进一步说明JAK／STAT信号途径可能在DN发病过程中发挥重要作用，进而为DN的预防和治疗提供又一个靶点。

本文第一作者简介：

陈红敏（1985～），女，汉族，硕士研究生，研究方向：糖尿病肾病的发病机制

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高糖培养人肾小球系膜细胞对JAK2／STAT1信号蛋白活化的影响

陈红敏，李 竞，高 凌，等／武汉大学人民医院内分泌科，武汉430060

目的：观察高糖对人肾小球系膜细胞（HMCs）Janus酪氨酸激酶2（JAK2）、信号转导和转录活化因子1（STAT1）以及转化生长因子—β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（FN）表达的影响。方法：将HMCs于高糖（30mmol／L）环境下培养不同时间后，Western blotting检测磷酸化JAK2、STAT1（p-JAK2、p-STAT1）水平；RT-PCR 检测TGF-β1和FN mRNA的表达；ELISA测定上清液中 TGF-β1和FN的含量，同时以低糖组作为对照。结果：与低糖对照组比较，高糖培养 H MCs p-JAK2、p—STAT1蛋白明显上调，TGF-β1和FN mRNA表达和蛋白水平显著增加（P＜0.01）。结论：高糖能通过激活HMCs中JAK2／STAT1信号途径，促进TGF—β1和细胞外基质分泌。

糖尿病肾病 细胞外基质 Janus酪氨酸激酶／信号转导和转录活化因子

人肾小球系膜细胞 高糖

Effect of High Concentration of Glucose on the Activation of Janus Kinase 2／Signal Transducers and Activators of Transcription 1（JAK2／STAT1）in Human Glomerular Me-sangial Cells

Chen Hongmin，Li Jing，Gao Ling，et al／Department of Endocrinology，Renmin Hospital of Wu-han Universty，Wuhan 430060

Objective：To investigate the effect of high concentration of glucose on the activation of janus kinase 2（JAK2）signal transducers and activa-tors of transcription 1（STAT1）and on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectin （FN）in human glomerular mesangial cells（H MCs）.Method：HMCs were treated with high glucose（30mmol／L glucose）for different time respectively.Tyrosine phosphoryl-ation of JAK2（p-JAK2）and STAT1（p-ATAT1）protein were detected by Western blotting.TGF-β1and FN mRNA was assessed by semi-quantita-tive reverse transcription and polymerase chain reaction（RT-PCR）.The protein synthesis of TGF-β1 and FN in the supernatants were determined by enzyme-linked immunoadsorbent assay（ELISA）low glucose as control group.Results：Compared with control group，the expression of p-JAK2，p-STAT1，TGF-β1mRNA，FN mRNA and the protein level of TGF-β1，FN were significantly incresed in HMCs under high concentration of glu-cose.Conclusion：Under high concentration of glucose，the overproduction of TGF-β1and FN in HMCs partly be attributable to the phosphorylation of JAK2／STAT1.

Diabetic nephropathy；Extracellular matrix；Janus ki-nase／signal transducers and activators of transcrip—tion；Human glomerular mesangial cell；High glucose

R587.2

A

1005—1740（2011）02—0023—04

武汉大学人民医院内分泌科，邮政编码 武汉430060； 通讯作者：李 竞，E-mail：lijing7823＠hotmail.com

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